تست cell free fetal DNA یا (cffDNA) یا Non Invasive Prenatal Testing یا (NIPT) یک تست غربالگری قبل از تولد برای غربال اختلالات کروموزومی شایع (مثل تریزومی 21، 18 و 13) و تعیین جنسیت به کار گرفته می شود.

به گزارش خبرنگار سایت پزشکان بدون مرز، بزرگترين ايراد در روش های سنتی غربالگری، درصد بالای نتايج مثبت کاذب و منفی کاذب و در موردآزمایش‌های تأئيدی، احتمال سقط جنين به علت تهاجمی بودن روش نمونه‌گيری است. نتیجه مثبت کاذب یعنی در عین حالیکه بیماری وجود ندارد جواب تست مثبت می‌شود. جواب منفی کاذب یعنی در حالیکه بیماری وجود دارد نتیجه تست منفی است.

در سال 1997 دانشمندان به وجود DNA جنین در خون مــادر پی بردند. این کشف مهم، اساسی شد برای ظهور روش‌های غیر تهاجمی تشخیص سندرم داون. بالاخره موفقیت واقعی در سال 2008 حاصل شد زمانیکه محققین، قدرت تشخیص اختلالات کروموزمی جنین را با استفاده از روش تعیین توالی DNA جنین در خون مادر با درستی حدود 100 درصد به اثبات رساندند.

اصول این روش بر پایه اندازه گیری DNA آزاد جنین در خون مادر است که از سلول های جفت آزاد می شوند. صاحب نظران، این کشف را یک انقلاب در روش‌های تشخیصی دوران بارداری می دانند و پیش بینی می کنند که در آینده نزدیک تست های مبتنی بر آن، به صورت کامل جایگزین روش های سنتی غربالگری گردد.

منشاء cffDNA از سلولهای تروفوبلاست جفت بوده و بدنبال پوسته ریزی سلولهای جفتی وارد گردش خون مادر می شود و 13- 3 درصد کل cell free maternal DNA مادر را تشکیل می دهد. در سه ماهه سوم بارداری این نسبت 10 الی 20% افزایش می یابد.

cffDNA در هفته 7 بارداری در خون مادر ظاهر شده و بلافاصله بعد از تولد از گردش خون وی پاک می شود، طوری که 2 ساعت پس از زایمان دیگر در خون مادر قابل تشخیص نمی باشد. از نظر سایز این مولکول خیلی کوچکتر از cell free maternal DNA بوده و سایزی در حدود 200-300 bp دارد و این خاصیت اساس بسیاری از تکنیکهای افتراق cffDNA از cell free maternal DNA را تشکیل می دهد.

البته بعضی از تکنیکهای قدیمتر از اختلافات موجود در نواحی اپی ژنیک cffDNA از cell free maternal DNA (مثل unmethylation index of the phosphodiesterases gene 9A و methylated DNA immunoprecipitation) استفاده می کنند. از آنجائیکه افتراق cffDNA از میان مقدار بالای cell free maternal DNA نیاز به تکنیک بسیار حساس و با دقت بالایی دارد بنابراین باید از تکنیک های بسیار پیشرفته که جهت آنالیز مولکولی مورد استفاده قرار می گیرد (مانند digital PCR و Massively Parallel Sequencing = MPS) برای تشخیص و جداسازی cffDNA استفاده کنند.

مطالعاتی که اخیراً گزارش شده است میزان تشخیص این روش را برای تریزومی 21 به میزان 99/9 درصد نشان می‌دهد. این بدین معناست که با این آزمایش می‌توان 99/9 درصد از موارد سندرم داون را تشخیص داد. یعنی میزان منفی کاذب آن کمتر از 0/1 درصد است.

عمر DNA جنین که در خون مادر وجود دارد بسیار کوتاه بوده و بلافاصله بعد از تولد از خون مادر محو می گردد بنابر این بارداری های قبلی اثری در نتیجه تست ندارد.

باید توجه داشت که انجام این تست، نیاز به آزمایش آلفا فتوپروتئین را برای بررسی اختلالات رشد لوله عصبی جنین در سه ماهه دوم از بین نبرده و خانم باردار باید حتما در هفته های 15 تا 20 بارداری مجدداً به آزمایشگاه مراجعه کند.

مزایای تست

*غیرتهاجمی بودن، برای انجام آزمایش فقط به چند سی سی از خون مادر احتیاج است.

* حساسیت و صحت بالای تست، (بیشتر از 99/9 درصد)

* تشخیص زودهنگام، آزمایش از هفته 10 بارداری قابل انجام بوده و این زمان به تصمیم گیری بهتر کمک می کند.

* جوابدهی سریع، جواب آزمایش طی 10 روز آماده می شود.

پیشنهادات :

1- به کاربردن این تست در مورد بارداری های پر خطر مانند زنان باردار بالای 35 سال و کسانی که نتیجه پرخطر (مثبت) در روش‌های غربالگری رایج داشته‌اند.

2- کاربرد این تست برای کسانی که از نحوه نمونه گیری روش های تهاجمی وحشت دارند.

3- انجام تست برای زنانی که نمی توانند خطر سقط در روش های تهاجمی را بپذیرند.

4- انجام آمنیوسنتز در مورد کسانی که نتیجه مثبت در تست NIPT داشته‌اند.

5- انجام آزمایش آلفافتوپروتئین در سه ماهه دوم برای بررسی اختلالات رشد لوله عصبی جنین.

کاربردهای تست NIPT

1- تعیین اختلالات کروموزومی نظیر سندرم داون (تریزومی 21)، سندرم ادوارد (تریزومی 18) و سندرم پاتو (تریزومی 13).

2- تعیین جنسیت در مواردی که احتمال وراثت اختلالات ژنتیکی مرتبط با کروموزوم X و یا X-Linked وجود دارد و یا احتمال وجود اختلالات ژنتیکی مرتبط با کروموزوم Y و یا Y-Linked است.

سردستة این اختلالات عبارتند از: سندرم X شکننده[4]، دیستروفی عضلانی دوشن[5] و هموفیلی می باشد. یعنی اگر مادری ناقل یک بیماری وابسته به کروموزوم X باشد امکان انتقال آنرا به جنین پسر خود را دارد و امکان بروز بیماری در پسران وی وجود دارد.

بنابراین اگر در این روش به تشخیص سریعتر جنین پسر برسیم ، می توانیم مشاوره ژنتیک و در صورت لزوم تست های ژنتیکی مورد نیاز را طراحی نمائیم.

اگر پدر خانواده ناقل ژن هایی که وابسته به اختلالات وابسته به کروموزوم Y و یا Y-Linked Disorders، باشد ، نیز کاندید مشاوره ژنتیک و یا تست های ژنتیکی در دوران بارداری می شوند. مثالهای معروف این اختلالات ، عبارتند از:

– ناباروری وابسته به کروموزوم Y و یا Y chromosome infertilty (نقصی در کروموزوم Y وجود دارد که می تواند آزوسپرمیا و یا اولیگوزوسپرمیا ایجاد کند)،

– بیماری Abnormal or Absent Testicular Development (نقص در ناحیه sex determining region Y = SRY) می باشد.

– بیماری رتینیت پیگمنتوزا ، که ژن فوق که به آن the RPY (retinitis pigmentosa, Y-linked) gene می گویند بر روی کروموزوم Y قرار داشته و دچار نقص شده است.

تعیین جنسیت در بیماریهایی که وابسته به کروموزوم های جنسی نیستند ولی جنسیت نقش مهمی در بروز یک سری از علائم مهم را دارد نیز اهمیت پیدا می کند. مثال معروف آن هیپرپلازی مادرزادی آدرنال[6] می باشد که طی آن به دلیل مهار مسیر تولید کورتیکواستروئیدها، مسیر تولید هورمون‌های آندروژن افزایش یافته و اگر جنین دختر باشد باعث مردانه شدن اندام تناسلی خارجی وی می گردد.

در این موارد باید از هفتة 7 بارداری درمان با دگزامتازون را برای جنین‌های دختر شروع کرد و مانع از ترشح آندروژن‌ها شد.

چه کسانی کاندید انجام تست NIPT هستند؟

طبق توصیه مشترک انجمن متخصصین زنان و زایمان آمریکا و انجمن طب مادر و جنین در سال 2015 و انجمن بین المللی غربالگری دوران بارداری در سال 2014 این تست را می توان به گروه های ذیل پیشنهاد نمود:

– زنان 35 سال یا بالاتر
– وجود یک تست غربالگری مثبت (مانند تست‌های غربالگری سه ماهة اول، دوم، اینتگریتد و یا سکوئنشیال).
– وجود یافتةای در سونوگرافی که نشان دهندة افزایش ریسک اختلالات کروموزومی است.
– وجود سابقة قبلی جنین و یا فرزند مبتلا به تریزومی‌ های شایع
– وجود سابقه خانوادگی ابتلا به تریزومی 21، 18 و 13
– عدم انجام تست های روتین غربالگری تا 22 هفتگی به هر دلیل و یا وجود یک یافته سونوگرافیک غیرطبیعی از هفته 22 به بعد

البته براساس یافته های آزمایشگاه نیلو بهترین گروه برای انجام این تست گروه های با خطر بینابین در پروتکل های غربالگری سه ماهه اول و دوم می باشند. در گروه های پرخطر هم در موارد ذیل می توان بعنوان یک پیش تست قبل از انجام تست های تشخیصی از این تست استفاده نمود:

– زنانی که ترس زیادی از نمونه گیری تست های تشخیصی مثل آمنیوسنتز و یا CVS دارند،

– زنانی که زیر بار ریسک سقط تست های تشخیصی نمی روند،

– زنانی که سابقه سقط مکرر (سه و یا بیشتر از سه سقط زیر 20 هفتگی و یا وزن جنین زیر 500 گرم) دارند،

– زنانیکه سابقه پارگی کیسه آب دارند،

– زنانیکه دارای جنین طلایی (جنینی که بعد از چندین سال ناباروری، والدین با سن بالا و یا حاصل از حاملگی IVF تشکیل شده اند) هستند.

نمونه‌ مورد نیاز

10 میلی لیتر خون از مادر که در ضد انعقاد حاوی EDTA گرفته می شود.

شرایط انجام تست

– حداقل سن بارداری 10 هفته
– بارداری تک قلویی و یا دو قلویی
– بارداری ناشی از IVF و یا رحم اجاره ای
– کشت سلولی در آمنیوسنتز به هر دلیلی موفقیت آمیز نمی باشد (نمونه آلوده به خون مادر باشد و یا سن بارداری بیشتر از 20 هفته باشد)

توجه1: در زنان باردار مبتلا به کانسر و یا زنان دارای سابقه دریافت خون طی 12 ماه گذشته دارند، این تست توصیه نمی شود.

توجه2: طبق یک متاآنالیزی که در سال 2016 توسط دکتر فلیپ تایلور و همکاران انجام شد، مشخص گردید که میزان قدرت تشخیص تست NIPT در بارداری دوقلویی نسبت به یک قلویی کاهش می یابد. این میزان کاهش در تریزومی 21 تا 9%، در تریزومی 18 تا 28% و در سندرم پاتو و یا تریزومی 13 تا 22% می باشد.

اساس آزمایش

هر فردی بطور نرمال 23 جفت کروموزوم دارد و هر کروموزوم از ساختمان حلقوی شکلی (DNA) تشکیل شده که حاوی ژن ها می باشد. در هر کروموزوم سکانس ها و یا توالی خاصی از مولکول DNA وجود دارد که ویژه هر کروموزوم است (بطور مثال 21q22 و یا ناحیه 2 از باند 2 از بازوی بلند کروموزوم 21 توالی و یا سکانس اختصاصی کروموزوم 21 است و بعنوان ناحیه Hot Spot و یا مهم کروموزوم 21 برای تشخیص کروموزوم 21 مورد استفاده قرار می گیرد).

با روش NGS می توان با شمردن تعداد این سکانس ها، مقدار دقیق هر کروموزوم را محاسبه نمود و در نتیجه می توان مجموع کل کروموزوم 21 موجود در خون مادر را نسبت به سایر کروموزوم ها مقایسه نمود. این نسبت همیشه معادل یک در یک مادر باردار حاوی جنین نرمال می باشد.

اگر جنین مبتلا به سندرم داون باشد به میزان خیلی کم سکانس های مربوط به کروموزوم 21، بیشتر بوده و در نتیجه در مقایسه با سایر کروموزوم ها بیشتر بوده و نسبت آن بالای یک می شود.

نتايج چگونه تفسير مي‌شوند؟

نتایج به سه صورت کم خطر، پرخطر و بدون نتیجه گزارش می شود:

کم خطر: نشانه آن است که به احتمال بیش از 99 درصد جنین از نظر اختلالات کروموزوم های 21، 18 و 13 در محدوده کم خطر می باشد
پر خطر: نشانه آن است که به احتمال بیش از 99 درصد جنین از نظر اختلالات کروموزوم های 21، 18 و 13 در محدوده پرخطر بوده و برای تأئید جواب باید یک تست تشخیصی تهاجمی نظیر آمنیوسنتز را انجام شود.
بدون نتیجه: در موارد خیلی نادر، بدلیل ناکافی بودن میزان cffDNA در خون مادر (ناشی از وزن بالای مادر و یا سن پایین جنین) تست جواب نداده و نیاز به خونگیری مجدد داریم.

مزایای این تست

تست NIPT نسبت به سایر تست های غربالگری این مزایا را دارد:

مثبت کاذب کمتر: احتمال مثبت کاذب این تست زیر یک درصد برای تریزومی های 21، 18 و 13 است.
قدرت تشخیص بالاتر: بدلیل تفکیک DNA آزاد موجود در گردش خون مادری با منشاء جنینی (cffDNA) از DNA آزاد با منشاء مادری (cfmDNA) که در این روش انجام می گیرد، قدرت تشخیص به بالای 99 درصد برای اختلالات کروموزوم های 21، 18 و 13 می رسد.
صحت بالای تعیین جنسیت: قدرت تشخیص جنسیت در این روش بالای 97% است که نسبت به بسیاری از تست های مشابه خود بالاتر است.
عدم وجود احتمال سقط جنین: بر خلاف روش های تشخیصی تهاجمی، بدلیل آنکه این تست فقط بر روی خون مادر انجام می شود، ریسکی برای ایجاد سقط جنین ندارد.
عدم تاثیر پذیری از بارداری های قبلی: از آنجائیکه نیمه عمر cffDNA کمتر از 2 ساعت است بنابراین بارداری های قبلی اختلالی در نتیجه تست ایجاد نمی کند.
o تشخیص زود هنگام: این تست از هفته 10 بارداری قابل انجام است.
o جوابدهی سریع: جواب بین 3 تا 7 روز کاری بعد از نمونه گیری آماده می شود.
o بهترین پروتکل غربالگری بعد از هفته 22 بارداری