تکنیک ایمونوسیتوشیمی روشی رایج جهت شناسایی پروتئین یا آنتی ژن خاص در سلول ها با استفاده از آنتی بادی اولیه خاص که به آن متصل می شود، است

✔️آنتی بادی اولیه به آنتی بادی ثانویه ای که با فلوئوروفور کانجوگه شده‌است، متصل می‌شود. به این ترتیب امکان مشاهده پروتئین در زیر میکروسکوپ فلوئورسنت فراهم می‌گردد. ایمونوسیتوشیمی (ICC) به محققین این امکان را می‌دهند تا بیان یا عدم بیان آنتی ژن مورد نظر را در سلول‌های نمونه بررسی کنند.

◀️تفاوت دو تکنیک ایمونوسیتوشیمی و ایمونوهیستوشیمی

✔️تکنیک ایمونوسیتوشیمی بر روی نمونه هایی از سلول های سالم انجام می شود که اکثر آنها دارای ماتریکس خارج سلولی می باشند. این تکنیک شامل سلول های منفرد جداشده از یک بلوک بافت جامد، سلول های کشت داده شده، سلول های معلق در سوسپانسیون و یا سلول هایی که از اسمیر تهیه شده، می باشد. در مقابل نمونه های ایمونوهیستوشیمی، بخش هایی از بافت بیولوژیکی هستند که هر سلول با بافت های اطراف احاطه شده است.

✔️نمونه هایی که از این طریق قابل بررسی هستند شامل: اسمیر خون، سواپ ها، سلول های کشت داده شده و سوسپانسیون سلولی می باشد.

✔️روش های مختلفی برای تهیه نمونه های سلولی جهت بررسی و آنالیز ایمونوسیتوشیمی وجود دارد. هر روش دارای نقاط قوت و خصوصیات منحصر به فرد خود می باشد، بنابراین بسته به نوع کار می توان از روش مناسب استفاده کرد. سلول هایی که رنگ آمیزی می شوند، می توانند به یک تکیه گاه متصل شوند تا در مراحل بعدی امکان بررسی آنها فراهم شود.

✔️این کار می تواند با چندین روش انجام شود؛ سلول های چسبنده ممکن است روی لام یا لامل های میکروسکوپ یا داخل پلیت کشت داده شوند. سلول های شناور را می توان بر روی اسلایدهای شیشه ای(سیتوپسین) سانتریفیوژ کرده و سپس با استفاده از لینکرهای شیمیایی روی سطح جامد متصل کرد و یا در برخی موارد به صورت شناور مورد بررسی قرار داد.

✔️واکنش های رخ داده در هسته ممکن است به راحتی در دسترس قرار نگیرد و مایعات خارج سلولی می توانند موانعی در عملکرد ایمونوسیتوشیمی ایجاد کنند. در این شرایط استفاده از مواردی که باعث ایجاد نفوذپذیری در سلول می شود مانند triton X-100 و Tween20 و یا فیکساتورهای آلی مثل استون، متانول و اتانول ضروری است.

✔️آنتی بادی ها یک ابزار مهم برای نشان دادن حضور و قرارگیری درون سلولی یک آنتی ژن هستند. به طور کلی در تکنیک ایمونوسیتوشیمی، هر آنتی بادی دارای جایگاه اختصاصی برای آنتی ژن مخصوص به خود است که به آن متصل می شود. این آنتی بادی ها معمولا با یک ماده فلورسنت (FITC یا PE) کونژوگه هستند. در هنگام عکسبرداری با میکروسکوپ فلورسنت، وجود نور سبز یا قرمز نشان دهنده حضور آنتی ژن یا پروتئین مورد نظر در داخل آن سلول می باشد.

◀️مراحل انجام تکنیک ایمونوسیتوشیمی ICC

➖ابتدا سلول ها را کشت داده و بعد از رشد کردن سلول ها و رسیدن به تراکم مناسب تقریبا ۷۰ تا ۸۰ درصد، محیط کشت را خالی و سپس دو بار به وسیله ی PBS شستشو می دهیم.

➖به منظور فیکس کردن سلول ها ۳۰۰ تا ۴۰۰ لاندا از پارا فرمالدهید ۲ تا ۴ درصد را به هر ول اضافه کرده و برای ۲۰ دقیقه در دمای اتاق انکوبه کرده و سپس سلول ها را دو بار با PBS شستشو می دهیم.

➖به هر ول ۳۰۰ تا ۴۰۰ لاندا بلاکینگ بافر (شامل سرم بز یا  سرم میمون با غلظت ۱۰ درصد و ترایتون با غلظت ۰/۳ درصد) اضافه و برای مدت ۴۵ دقیقه در دمای اتاق انکوبه می کنیم.

➖سلول ها را بوسیله PBS شستشو می دهیم.

➖آنتی بادی اولیه را در غلظت مناسب آماده کرده و مقدار مناسبی از آن را به هر ول اضافه کرده و سپس برای مدت ۲ تا ۳ ساعت در دمای اتاق یا یک شب در دمای ۴ درجه سانتی گراد انکوبه میکنیم و بعد از این مدت با   PBS شستشو می دهیم.

➖آنتی بادی ثانویه متصل به فلوروکروم را با توجه به دستورالعمل شرکت سازنده رقیق نموده سپس در تاریکی به هر ول مقدار مناسبی اضافه کرده و برای مدت یک ساعت در تاریکی انکوبه می نمائیم، بعد از آن با PBS  شستشو می دهیم.

➖ ۳۰۰ لاندا از محلول DAPI رقیق شده را به هر ول اضافه کرده و به مدت ۱۰ دقیقه در دمای اتاق انکوبه کرده و سپس با PBS شستشو می دهیم.



تاریخ انتشار: 20:49:19 1400/05/03