کشت سلولی یک تکنیک بیوتکنولوژیکی بسیار مهم در دنیای علمی است. میتوان آنرا به عنوان بستری تعریف کرد که به درمان بیماریهای مختلف و توسعه تکنیکهای تشخیصی مربوطه کمک میکند. این تکنیک شامل جداسازی سلولهای استخراج شده از بدن گیاه، حشره یا حیوان و رشد مصنوعی آنها میشود.
◀️اصول و کاربردهای کشت سلول حیوانی
🖍بسیاری از محصولات بیوتکنولوژی (مانند واکسنهای ویروسی) اساساً به کشت سلول حیوانی وابسته هستند. گاهی اوقات پروتئینهای سادهتر با استفاده از rDNA در کشتهای باکتریایی تولید میشوند. اما پروتئینهای پیچیدهتری که گلیکوزیله شدهاند (تغییر شده با کربوهیدرات) در حال حاضر باید در سلولهای حیوانی ساخته شوند.
🖍کشت سلول حیوانی درحال حاضر برای بررسی عوامل ضد سرطان، آنزیمها، ایمونوبیولوژیکها اینترلوکینها، لنفوکینها، آنتی بادی های مونوکلونال (mABs) و هورمونها استفاده میشود.
🖍سلولها در آزمایشگاهها در پتری دیش یا فلاسکها در محیط مناسب و تحت شرایط محیطی بسیار کنترل شده رشد میکنند. شرایط محیطی که مورد توجه قرار میگیرد عبارتند از PH، دما، اسمولالیته، ترکیب غذایی و غیره.
🖍از همینرو، محیط کشت نقش اساسی در تکنیکهای کشت سلول حیوانی ایفا میکند. بهطور معمول، محیط مورد استفاده در کشت سلول حیوانی دارای اجزایی مانند ویتامینها، اسیدهای آمینه، گلوکز، سرم، نمکهای معدنی، عوامل چسبندگی و هورمونها است.
◀️مراحل کشت سلول حیوانی
🖍کشت سلول حیوانی به طور کلی شامل مراحل اصلی زیر است:
◼️برداشت سلولها
◻️جداسازی سلولها با استفاده از آنزیمهای مناسب.
◼️کشت در یک ظرف با محیط رشد مناسب
◻️کشت در انکوباتور
◼️انجام روشهای آزمایشگاهی
◀️اجزای اصلی برای کشت سلولی حیوانی به شرح زیر است:
➖منابع انرژی: گلوکز، فروکتوز، اسیدهای آمینه
➖منابع نیتروژن: اسیدهای آمینه
➖ویتامینها: معمولاً ویتامین های محلول در آب B و C هستند.
➖نمکهای معدنی: Na+، K+، Ca2+، Mg2+
➖چربی و اجزای محلول در چربی: اسیدهای چرب، کلسترول
➖آنتی بیوتیکها
➖عوامل رشد و هورمون ها
➖اکسیژن و CO2
◀️به طور کلی در کشت بافت حیوانی از ۲ نوع محیط کشت استفاده میشود:
1️⃣محیط کشت طبیعی
2️⃣محیط کشت مصنوعی
🖍نوع محیط اساساً به نوع سلولی که باید کشت شود و اهداف آن بستگی دارد.
1️⃣ محیط کشت طبیعی
🖍این محیطها معمولا شامل سه نوع ماده زیر هستند:
👈لختهها: لختههای پلاسما رایج ترین لختهها هستند. در حال حاضر، پلاسما به صورت تجاری در حالت مایع یافت میشود که میتواند در آزمایشگاه مورد استفاده قرار گیرد.
👈مایعات بیولوژیکی: از چندین مایع بیولوژیکی میتوان به عنوان محیط کشت استفاده کرد مانند مایع آمنیوتیک، مایع جنب ، همولنف حشرات، آب هومورال چشم، سرم و غیره. در این بین، سرم بیشتر ترجیح داده میشود.
👈عصاره بافت: رایجترین عصاره بافتی که در کشت سلول حیوانی استفاده میشود عصاره جنین جوجه است. اما از عصاره جنین گاو نیز استفاده میشود. عصاره طحال، کبد، مغز استخوان و لکوسیتها نیز گاهی مورد استفاده قرار میگیرند. مخلوطی از اسیدهای آمینه و برخی ترکیبات آلی میتواند جایگزینی برای عصاره بافت باشد.
🖍طیف وسیعی از سلولهای استخراج شده از حیوانات را میتوان به راحتی با استفاده از محیطهای طبیعی کشت داد. با این وجود مواد موجود در محیط کشتهای طبیعی به درستی تعریف نشدهاند. به همین دلیل است که شناخت ترکیب صحیح اجزای موجود در این محیطها دشوار است. به دلیل عدم آگاهی در مورد ترکیب چنین محیطهای طبیعی، برخی از سلولها قادر به رشد یا تکثیر به میزان مطلوب نیستند.
2️⃣محیط کشت مصنوعی در کشت سلول حیوانی
🖍محیطهای مصنوعی معمولاً از مواد مغذی آلی و معدنی تشکیل شدهاند. محیط کشتهای مصنوعی همچنین حاوی ویتامینها، کربوهیدراتها، کوفاکتورها، نمکها، سرم و غیره هستند. محیطهای مصنوعی برای کشت سلول حیوانی از رشد نامحدود سلولها حمایت میکنند. انواع مختلفی از محیطهای مصنوعی وجود دارد که در مقایسه با محیط کشتهای طبیعی بسیار بهینهتر هستند.
🖍محیط کشت مصنوعی در کشت سلول حیوانی معمولا به دلایل زیر مورد استفاده قرار میگیرند:
◼️بقای کوتاه مدت
◻️بقای طولانی مدت
◼️رشد نامحدود
🖍محیط مصنوعی در کشت سلول حیوانی را میتوان به انواع زیر طبقه بندی کرد:
◼️محیط حاوی سرم
◻️محیط بدون سرم
◼️محیط بدون پروتئین
◻️محیط شیمیایی تعریف شده
تاریخ انتشار: 12:11:59 1402/05/19
◀️اصول و کاربردهای کشت سلول حیوانی
🖍بسیاری از محصولات بیوتکنولوژی (مانند واکسنهای ویروسی) اساساً به کشت سلول حیوانی وابسته هستند. گاهی اوقات پروتئینهای سادهتر با استفاده از rDNA در کشتهای باکتریایی تولید میشوند. اما پروتئینهای پیچیدهتری که گلیکوزیله شدهاند (تغییر شده با کربوهیدرات) در حال حاضر باید در سلولهای حیوانی ساخته شوند.
🖍کشت سلول حیوانی درحال حاضر برای بررسی عوامل ضد سرطان، آنزیمها، ایمونوبیولوژیکها اینترلوکینها، لنفوکینها، آنتی بادی های مونوکلونال (mABs) و هورمونها استفاده میشود.
🖍سلولها در آزمایشگاهها در پتری دیش یا فلاسکها در محیط مناسب و تحت شرایط محیطی بسیار کنترل شده رشد میکنند. شرایط محیطی که مورد توجه قرار میگیرد عبارتند از PH، دما، اسمولالیته، ترکیب غذایی و غیره.
🖍از همینرو، محیط کشت نقش اساسی در تکنیکهای کشت سلول حیوانی ایفا میکند. بهطور معمول، محیط مورد استفاده در کشت سلول حیوانی دارای اجزایی مانند ویتامینها، اسیدهای آمینه، گلوکز، سرم، نمکهای معدنی، عوامل چسبندگی و هورمونها است.
◀️مراحل کشت سلول حیوانی
🖍کشت سلول حیوانی به طور کلی شامل مراحل اصلی زیر است:
◼️برداشت سلولها
◻️جداسازی سلولها با استفاده از آنزیمهای مناسب.
◼️کشت در یک ظرف با محیط رشد مناسب
◻️کشت در انکوباتور
◼️انجام روشهای آزمایشگاهی
◀️اجزای اصلی برای کشت سلولی حیوانی به شرح زیر است:
➖منابع انرژی: گلوکز، فروکتوز، اسیدهای آمینه
➖منابع نیتروژن: اسیدهای آمینه
➖ویتامینها: معمولاً ویتامین های محلول در آب B و C هستند.
➖نمکهای معدنی: Na+، K+، Ca2+، Mg2+
➖چربی و اجزای محلول در چربی: اسیدهای چرب، کلسترول
➖آنتی بیوتیکها
➖عوامل رشد و هورمون ها
➖اکسیژن و CO2
◀️به طور کلی در کشت بافت حیوانی از ۲ نوع محیط کشت استفاده میشود:
1️⃣محیط کشت طبیعی
2️⃣محیط کشت مصنوعی
🖍نوع محیط اساساً به نوع سلولی که باید کشت شود و اهداف آن بستگی دارد.
1️⃣ محیط کشت طبیعی
🖍این محیطها معمولا شامل سه نوع ماده زیر هستند:
👈لختهها: لختههای پلاسما رایج ترین لختهها هستند. در حال حاضر، پلاسما به صورت تجاری در حالت مایع یافت میشود که میتواند در آزمایشگاه مورد استفاده قرار گیرد.
👈مایعات بیولوژیکی: از چندین مایع بیولوژیکی میتوان به عنوان محیط کشت استفاده کرد مانند مایع آمنیوتیک، مایع جنب ، همولنف حشرات، آب هومورال چشم، سرم و غیره. در این بین، سرم بیشتر ترجیح داده میشود.
👈عصاره بافت: رایجترین عصاره بافتی که در کشت سلول حیوانی استفاده میشود عصاره جنین جوجه است. اما از عصاره جنین گاو نیز استفاده میشود. عصاره طحال، کبد، مغز استخوان و لکوسیتها نیز گاهی مورد استفاده قرار میگیرند. مخلوطی از اسیدهای آمینه و برخی ترکیبات آلی میتواند جایگزینی برای عصاره بافت باشد.
🖍طیف وسیعی از سلولهای استخراج شده از حیوانات را میتوان به راحتی با استفاده از محیطهای طبیعی کشت داد. با این وجود مواد موجود در محیط کشتهای طبیعی به درستی تعریف نشدهاند. به همین دلیل است که شناخت ترکیب صحیح اجزای موجود در این محیطها دشوار است. به دلیل عدم آگاهی در مورد ترکیب چنین محیطهای طبیعی، برخی از سلولها قادر به رشد یا تکثیر به میزان مطلوب نیستند.
2️⃣محیط کشت مصنوعی در کشت سلول حیوانی
🖍محیطهای مصنوعی معمولاً از مواد مغذی آلی و معدنی تشکیل شدهاند. محیط کشتهای مصنوعی همچنین حاوی ویتامینها، کربوهیدراتها، کوفاکتورها، نمکها، سرم و غیره هستند. محیطهای مصنوعی برای کشت سلول حیوانی از رشد نامحدود سلولها حمایت میکنند. انواع مختلفی از محیطهای مصنوعی وجود دارد که در مقایسه با محیط کشتهای طبیعی بسیار بهینهتر هستند.
🖍محیط کشت مصنوعی در کشت سلول حیوانی معمولا به دلایل زیر مورد استفاده قرار میگیرند:
◼️بقای کوتاه مدت
◻️بقای طولانی مدت
◼️رشد نامحدود
🖍محیط مصنوعی در کشت سلول حیوانی را میتوان به انواع زیر طبقه بندی کرد:
◼️محیط حاوی سرم
◻️محیط بدون سرم
◼️محیط بدون پروتئین
◻️محیط شیمیایی تعریف شده
👈 محیطهای حاوی سرم
🖍سرم مایع زرد رنگ و شفافی است که پس از حذف فیبرین و سلولها از خون باقی میماند. محیطهای کشت طبیعی، حدود۱۰-۲ درصد سرم دارند. این ماده مواد مغذی اساسی سلولها را تامین میکند. همچنین حاوی چندین هورمون و فاکتورهای رشد مختلف است.
🖍رایجترین مکمل مورد استفاده در کشت سلول حیوانی سرم جنین گاوی (FBS) است.
🖍با این حال، وجود سرم در یک محیط کشت سلولی حیوانی میتواند معایب بسیار زیادی داشته باشد. به عنوان مثال خطر آلودگی میکروبی.
👈 محیط کشت بدون سرم در کشت سلول حیوانی
🖍وجود سرم در مورد مطالعات ایمونولوژیک کشت سلول حیوانی، میتواند منجر به تفسیرهای نادرست شود.
🖍محیط کشتهای بدون سرم نیز در کشت سلول حیوانی رایج هستند. این محیطها برای غلبه بر مشکلات ناشی از محیطهای حاوی سرم، مورد استفاده قرار گرفتند. فرمولاسیون چنین محیطی در ابتدا بهطور خاص برای حمایت از کشت سلولهای بنیادی انجام شد. این محیطها همچنین حاوی مقادیر مشخصی از فاکتورهای رشد و پروتئین هستند.
👈 محیطهای بدون پروتئین
🖍 محیط کشتهای بدون پروتئین فقط دارای اجزای غیر پروتئینی هستند. استفاده از این محیطها در مقایسه با محیطهای حاوی سرم باعث رشد بهتر سلولها میشود. محیطهای بدون پروتئین فاقد هر گونه پروتئین هستند و فقط شامل ترکیبات غیر پروتئینی می شوند.
👈محیطهای شیمیایی تعریف شده
🖍این محیطها حاوی مواد معدنی و آلی فوقالعاده خالص و عاری از آلایندهها هستند. همچنین ممکن است حاوی مواد افزودنی پروتئین خالص مانند فاکتورهای رشد باشند.
🖍ترکیبات آنها با اصلاح ژنتیکی در باکتریها یا مخمرها با افزودن ویتامین ها، کلسترول، اسیدهای آمینه خاص و اسیدهای چرب تولید میشود.
◀️خواص فیزیکی و شیمیایی محیط کشت
🖍یکی از نکات مهم در کشت سلول حیوانی ، توجه به خواص فیزیکی و شیمیایی محیط کشت است. به منظور ارتقاء رشد و تکثیر خوب سلول های کشت شده، محیط کشت باید دارای خواص فیزیکی و شیمیایی خاصی باشد.
1️⃣معیار pH
🖍اکثر سلولها میتوانند در محدوده pH 7.0-7.4 رشد کنند، اما بسته به نوع سلول تفاوتهای جزئی وجود دارد. معمولاً از فنل قرمز به عنوان شاخص pH استفاده میشود. این ماده در pH 7.0 نارنجی، در pH 6.5 زرد، زیر pH 6.5 زرد لیمویی، در pH 7.6 صورتی و در pH 7.8 بنفش میشود. در pH 7.4 نیز قرمز است.
2️⃣مقدار CO2، بی کربنات و بافر
🖍مقدار pH با افزایش CO2 اتمسفر کاهش مییابد و محیط اسیدی میشود.
3️⃣ اکسیژن
🖍اغلب سلولهای in vivo برای زنده ماندن به اکسیژن نیاز دارند. اما غلظت بالای اکسیژن در محیط کشت میتواند به دلیل تولید رادیکالهای آزاد سمی باشد. برای کاهش سمیت O2، اغلب افزودن سلنیوم به محیط توصیه میشود. زیرا سلنیوم یک کوفاکتور برای سنتز گلوتاتیون است. با این وجود توصیه میشود به دستورالعملهای آزمایشگاه خود رجوع کنید.
4️⃣درجه حرارت
🖍به طور خاص، دمای بهینه برای یک کشت سلولی به دمای بدن ارگانیسم بستگی دارد. بنابراین دمای بهینه برای سلولهای به دست آمده از انسان و حیوانات خون گرم، ۳۷ درجه سانتی گراد است. سلولهای آزمایشگاهی نمیتوانند دمای بالاتر را کنترل کنند. اگر دما از ۴۰ درجه سانتیگراد فراتر رود، بیشتر آنها میمیرند.
🖍بنابراین برای نتایج قابل تکرار، حفظ دمای ثابت (۰٫۵ ± درجه سانتیگراد) مهم است. اگر سلولها از پرندگان جمع آوری شوند، دمای بهینه برای کشت اندکی بالاتر است (۳۸٫۵ درجه سانتیگراد).
🖍دمای کشت برای حیوانات خونسرد (poikilotherms) می تواند حدود ۱۵-۲۵ درجه سانتیگراد باشد. دما علاوه بر تأثیر مستقیم بر رشد سلولی، بر حلالیت CO2 نیز تأثیر می گذارد. دمای بالاتر حلالیت را افزایش می دهد.
5️⃣ اسمولالیته
🖍اسمولاریته یک پارامتر مهم در کشت سلول حیوانی است. زیرا سبب شباهت محیط کشت با محیط طبیعی میشود . اگر اسیدها، بازها، داروها و غیره روی محیط اعمال شوند، اسمولاریته تحت تأثیر قرار میگیرد.
🖍سرم مایع زرد رنگ و شفافی است که پس از حذف فیبرین و سلولها از خون باقی میماند. محیطهای کشت طبیعی، حدود۱۰-۲ درصد سرم دارند. این ماده مواد مغذی اساسی سلولها را تامین میکند. همچنین حاوی چندین هورمون و فاکتورهای رشد مختلف است.
🖍رایجترین مکمل مورد استفاده در کشت سلول حیوانی سرم جنین گاوی (FBS) است.
🖍با این حال، وجود سرم در یک محیط کشت سلولی حیوانی میتواند معایب بسیار زیادی داشته باشد. به عنوان مثال خطر آلودگی میکروبی.
👈 محیط کشت بدون سرم در کشت سلول حیوانی
🖍وجود سرم در مورد مطالعات ایمونولوژیک کشت سلول حیوانی، میتواند منجر به تفسیرهای نادرست شود.
🖍محیط کشتهای بدون سرم نیز در کشت سلول حیوانی رایج هستند. این محیطها برای غلبه بر مشکلات ناشی از محیطهای حاوی سرم، مورد استفاده قرار گرفتند. فرمولاسیون چنین محیطی در ابتدا بهطور خاص برای حمایت از کشت سلولهای بنیادی انجام شد. این محیطها همچنین حاوی مقادیر مشخصی از فاکتورهای رشد و پروتئین هستند.
👈 محیطهای بدون پروتئین
🖍 محیط کشتهای بدون پروتئین فقط دارای اجزای غیر پروتئینی هستند. استفاده از این محیطها در مقایسه با محیطهای حاوی سرم باعث رشد بهتر سلولها میشود. محیطهای بدون پروتئین فاقد هر گونه پروتئین هستند و فقط شامل ترکیبات غیر پروتئینی می شوند.
👈محیطهای شیمیایی تعریف شده
🖍این محیطها حاوی مواد معدنی و آلی فوقالعاده خالص و عاری از آلایندهها هستند. همچنین ممکن است حاوی مواد افزودنی پروتئین خالص مانند فاکتورهای رشد باشند.
🖍ترکیبات آنها با اصلاح ژنتیکی در باکتریها یا مخمرها با افزودن ویتامین ها، کلسترول، اسیدهای آمینه خاص و اسیدهای چرب تولید میشود.
◀️خواص فیزیکی و شیمیایی محیط کشت
🖍یکی از نکات مهم در کشت سلول حیوانی ، توجه به خواص فیزیکی و شیمیایی محیط کشت است. به منظور ارتقاء رشد و تکثیر خوب سلول های کشت شده، محیط کشت باید دارای خواص فیزیکی و شیمیایی خاصی باشد.
1️⃣معیار pH
🖍اکثر سلولها میتوانند در محدوده pH 7.0-7.4 رشد کنند، اما بسته به نوع سلول تفاوتهای جزئی وجود دارد. معمولاً از فنل قرمز به عنوان شاخص pH استفاده میشود. این ماده در pH 7.0 نارنجی، در pH 6.5 زرد، زیر pH 6.5 زرد لیمویی، در pH 7.6 صورتی و در pH 7.8 بنفش میشود. در pH 7.4 نیز قرمز است.
2️⃣مقدار CO2، بی کربنات و بافر
🖍مقدار pH با افزایش CO2 اتمسفر کاهش مییابد و محیط اسیدی میشود.
3️⃣ اکسیژن
🖍اغلب سلولهای in vivo برای زنده ماندن به اکسیژن نیاز دارند. اما غلظت بالای اکسیژن در محیط کشت میتواند به دلیل تولید رادیکالهای آزاد سمی باشد. برای کاهش سمیت O2، اغلب افزودن سلنیوم به محیط توصیه میشود. زیرا سلنیوم یک کوفاکتور برای سنتز گلوتاتیون است. با این وجود توصیه میشود به دستورالعملهای آزمایشگاه خود رجوع کنید.
4️⃣درجه حرارت
🖍به طور خاص، دمای بهینه برای یک کشت سلولی به دمای بدن ارگانیسم بستگی دارد. بنابراین دمای بهینه برای سلولهای به دست آمده از انسان و حیوانات خون گرم، ۳۷ درجه سانتی گراد است. سلولهای آزمایشگاهی نمیتوانند دمای بالاتر را کنترل کنند. اگر دما از ۴۰ درجه سانتیگراد فراتر رود، بیشتر آنها میمیرند.
🖍بنابراین برای نتایج قابل تکرار، حفظ دمای ثابت (۰٫۵ ± درجه سانتیگراد) مهم است. اگر سلولها از پرندگان جمع آوری شوند، دمای بهینه برای کشت اندکی بالاتر است (۳۸٫۵ درجه سانتیگراد).
🖍دمای کشت برای حیوانات خونسرد (poikilotherms) می تواند حدود ۱۵-۲۵ درجه سانتیگراد باشد. دما علاوه بر تأثیر مستقیم بر رشد سلولی، بر حلالیت CO2 نیز تأثیر می گذارد. دمای بالاتر حلالیت را افزایش می دهد.
5️⃣ اسمولالیته
🖍اسمولاریته یک پارامتر مهم در کشت سلول حیوانی است. زیرا سبب شباهت محیط کشت با محیط طبیعی میشود . اگر اسیدها، بازها، داروها و غیره روی محیط اعمال شوند، اسمولاریته تحت تأثیر قرار میگیرد.
منبع: کانال مرکز مهندسی ژنتیک و بیوتکنولوژی
تاریخ انتشار: 12:11:59 1402/05/19
سایر مطالب
جداسازی و کشت قارچ ها انواع نشانگر pH در محیط کشت و تاثیر هریک بر انواع باکتریها همینولپیس نانا (کرم نواری کوتوله): پاتوژنز و تشخیص آزمایشگاهی پیامد تغییر سطح استروژن در مردان شاخص های (اندکس های) خونی مورد سنجش در آزمایش CBC کاهش بخارات سمی در آزمایشگاه و اصول نگهداری صحیح زبالههای شیمیایی چکیده ای از آنالیز ادرار ( urinalysis) آزمایش بیوره : اصول و موارد استفاده از این تست چسب اسکاچ کرمک برای تشخیص انگل در کودکان آزمایش تکه تکه شدن DNA اسپرم (DFI) تشخیص ایمونولوژیک سندرم شوگرن آزمایشات بالینی تشخیص پروتئینوری اریتروسیتوز روش پاپ اسمیر استاندارد Thin Prep تشخیص ایمونولوژی بیماری میاستنی گراویس(Myasthenia Gravis)