نام اختصاری: C. Diff Toxin

سایر نام ها: سنجش سم کلستریدیوم دیفی سیل، بررسی کولیت آنتی بیوتیکی، بررسی کولیت سودومامبرانوی توکسیک

clostridial Toxin A/B assay, Clostridium difficile Cytotoxicity Assay, Clostridium difficile toxin Antibody , C. difficile Toxin B Screen

            بخش انجام دهنده: ایمونولوژی

نوع نمونه قابل اندازه گیری: مدفوع تازه، فریز شده

حجم نمونه مورد نیاز:   جامد:  به مقدار کم (به قطر 3 میلی متر)    مایع:   یک قطره (50  میکرولیتر )

شرایط نمونه گیری:

1.        روش جمع آوری مدفوع را برای بیمار شرح دهید. روشی ساده و مبتنی بر واقعیت اتخاذ کنید تا بیمار حجالت زده نگردد.

2.        به بیمار آموزش دهید تا ادرار یا کاغذ توالت را با نمونه مدفوع مخلوط نکند.

3.        به هنگام انتقال نمونه مراقب باشید، زیرا ممکن است نمونه عفونت زا باشد. در صورت همکاری پرستار در جمع آوری نمونه، باید دستکش پوشیده شود.    

ملاحظات نمونه گیری:

1.        نمونه های مدفوع باید در ظروف پلاستیکی تمیز و ضد نشت جمع آوری گردد.

2.        جهت جمع آوری نمونه، از سواپ مقعدی نمی توان استفاده نمود، زیرا با این روش نمی توان به مقدار کافی مدفوع جمع آوری کرد. مدفوع را نباید از درون توالت جمع آوری نمود.

3.        مدفوع را می توان از روی پوشاک های ویژه بیماران دچار بی اختیاری نیز جمع آوری نمود.

4.        نمونه را در یک ظرف دربسته بریزید و برای جلوگیری از تجزیه سم، سریعاً به آزمایشگاه انتقال دهید.

5.        چنانچه آزمایش بلافاصله انجام نمی پذیرد، نمونه را بسته به دستور آزمایشگاه در یخچال نگاه دارید.

شرایط نگهداری:

1.        نمونه تازه در بیماری که تحت درمان قرار نگرفته باید در 2-8^oC  نگهداری شده و در ظرف 48 ساعت از زمان جمع آوری آنالیز گردد.

2.        در صورت انجام نشدن آزمون بر روی نمونه تازه درمان نشده در ظرف 48 ساعت، نمونه باید در -20^oC یا پایین تر نگهداری شده و در ظرف دو ماه از زمان جمع آوری آنالیز گردد. از ذوب وفریز متعدد نمونه اجتناب نمایید.

3.        نمونه های مدفوع جمع آوری شده در محیط کری- بلایر باید در دمای یخچال (2-8^oC) نگهداری شده و در ظرف یک هفته از زمان جمع آوری آنالیز گردد یا باید در  20^oC - یا پایین تر نگهداری شده و در ظرف 2 ماه آزمایش شود. از ذوب وفریز متعدد نمونه اجتناب نمایید.

4.        نمونه های مدفوع که تغلیظ گشته اند یا با فیکساتیوهای PVA درمان گشته اند، برای انجام این تست مناسب نیستند.

موارد عدم پذیرش نمونه:

ü      ذوب و فریز متعدد نمونه

ü      نمونه بیش از حد گرم شده

ü      نمونه های مدفوع تغلیظ شده (formed stools) یا مدفوع‏های غیراسهالی

ü      نمونه های فیکس شده با فرمالین یا PVA

ü      نمونه ای که بیش از یک بار در 24 ساعت (Multiple specimens) جمع آوری شده باشد

کاربردهای بالینی:

1.      تشخیص کولیت پسودوممبرانو (غشای کاذب)وابسته به مصرف آنتی‏بیوتیک ناشی از توکسین‏کلستردیوم دیفی سیل (C.difficile)،

2.        ارزیابی سم C.difficile در بیماران مبتلا به اسهال که بیش از 5 روز تحت درمان آنتی بیوتیکی بستری بوده اند،

3.        ارزیابی سم C.difficile سیل در بیماران اسهالی دچار سرکوب سیستم ایمنی ( حتی اگر تحت درمان با آنتی بیوتیک نباشند) ، بستری شده در بخش ICU، جراحی یا کانسر

          روش متداول: Rapid lateral flow immunoassay، Enzyme Immunoassay for Toxin A/B

روش ارجح: (Real-Time PCR using Light Cycler and Fluorescent Resonance Energy Transfer (FRET

سایر روشها:                             Clostridium difficile Culture with Reflex to Cytotoxin Cell Assay

                                                Clostridium difficile Cytotoxin Antibody by Neutralization

   Latex Agglutination test, Fluorescence Immunoassay,                                                                                    

مقادیر طبیعی: منفی ( عدم وجود مقادیر قابل شناسایی سم C.difficile)

تفسیر: وجود توکسین نشانگر وجود بیماری است. جدا نمودن باکتری  C.difficile ممکن است در 5  تا 21 درصد از بالغین نرمال و 50 درصد از نوزادان سالم مشاهده گردد. بنابراین جدا نمودن ارگانیسم بدون وجود توکسین، یافتة غیراختصاصی بوده و چیزی را ثابت نمی‏کند. در صورت مشاهده علائم بالینی، یک نتیجه منفی، عدم وجود توکسین باکتری را رد نمی کند. این ممکن است زمانی که مقادیر توکسین کمتر از حد قابل شناسایی باشد رخ دهد. نمی توان شدت مقادیر توکسین باکتری را با شدت علائم بالینی بیمار مرتبط دانست. تشخیص قطعی اسهال ناشی از کلستردیوم دیفی سیل بر اساس معیار های بالینی ، تاریخچه بیماری و تست های آزمایشگاهی صورت می گیرد.

بیماران دچار ضعف سیستم ایمنی، یا تحت درمان با آنتی بیوتیک های وسیع الطیف (مثل کلیندومایسین، آمپی سیلین و سفالوسپورین ها) ممکن است دچار عفونت با C.difficile گردند. این عفونت ناشی از سرکوب جمعیت طبیعی باکتری های روده به علت تجویز آنتی بیوتیک ها  و غالب شدن جمعیت این باکتری در روده ها می باشد.

اطلاعات تکمیلی:

باکتری کلستردیوم دیفی سیل یک بخش از فلور نرمال مجاری گوارشی می باشد. این باکتری، اسپوردار غیرهوازی است و با تجویز آنتی بیوتیک های وسیع الطیف بر جمعیت سایر فلور نرمال غالب می شود. C.difficile یکی از رایج ترین پاتوژن های بیمارستانی، خانه های بهداشت و سایر مؤسسات پزشکی می باشد. اسپورهای کلستردیوم دیفی سیل به انتشار ارگانیسم در بیمارستانها کمک می کند و موجب مقاومت آن به تمام ترکیبات پاک کننده و دترجنت ها ( به استثناء مواد سفید کننده) می گردد.    

C.difficile عامل اسهال ناشی از آنتی بیوتیک ( فرم خفیف تا شدید) و کولیت غشای کاذب (PC) است. PC یک التهاب شدید کولون است که می تواند تحدید کننده حیات باشد بویژه در میان افراد مسن. PC ناشی از عفونت C.difficile ناشی از سویه های توکسین زای این باکتری می باشد. علائم بالینی PC  در ابتدا مرتبط به توکسین A ( یک انتروتوکسین آسیب رسان بافتی) می باشد. C.difficile همچنین تولید کننده یک سیتوتوکسین به نام توکسین B می باشد. سویه های C.difficile شامل سویه دارای هردو توکسین، سویه دارای توکسین B و سویه بدون توکسین می باشند. شناسایی این آنتی ژن ها در نمونه های  مدفوع یک شاخص معتبر از سویه های توکسین زا می باشد.

محدودیت ها و عوامل مداخله گر :

§         جمع آوری صحیح نمونه و پردازش آن  در دستیابی به نتایج درست ضروری است.

§         آزمایش آگلوتیناسیون لاتکس، آزمایش ساده و سریع است اما نمی‏تواند توکسین A را شناسایی نماید و سبب نتایج غیرقابل اعتماد می‏گردد. روش‏های نوین ایمونواسی قابلیت ردیابی توکسین A و B را بطور همزمان دارند. 

§         نمونه های مدفوع تغلیظ شده یا درمان شده با فیکساتیو برای انجام تست مناسب نمی باشد.

§         اختصاصیت آنالیتیکی تست در نمونه های مدفوع حاوی سوبستراهای بالقوه مداخله گر در غلظت های نسبی بالینی باید تعیین گردد.

§         این سوبسترا ها عبارتند از؛ خون انسان (5% v/v)، موسین (3.5% w/v)، چربی مدفوع (اسید استئاریک 5% w/v)، بیسموت (5% v/v)، ایمودیوم A-D (لوپرامید HCl) (5% v/v)، کوآپکتات (Attapugite) (5% v/v)، وانکومایسین (0.25% w/v)، مترونیدازول (0.25% w/v)، باریوم سولفات (5% w/v)، کلسیم کربنات (5% w/v)، هیچ یک از سوبستراهای فوق در مقادیر ذکر شده در نتایج تست تداخل نمی کنند.

§         در نمونه حاوی خون کامل انسانی در غلظت بیش از 10% v/v، نتایج مثبت کاذب مشاهده شده است.

§         نمونه های مشکوک که به بطور تیپیک مثبت یا منفی نمی شوند باید دوباره نمونه گیری شوند و تست تکرار گردد.

توضیحات:

·         اسهال ناشی از C.difficile عفونت شایع اکتسابی در بیمارستان است.

·         فاکتورهای خطر برای ابتلا به کولیت پسودوممبرانو  ناشی از C.difficile شامل درمان آنتی‏بیوتیکی، مصرف داروهای ضد ایدز یا ضدنئوپلاسم، استفاده از سفالوسپورین‏های نسل دوم و سوم، کلیندامایسین، آمپی‏سیلین و آموکسی‏سیلین می‏باشند.

·         سویه‏های توکسین‏زا معمولاً دو نوع توکسین تولید می‏نمایند، توکسین A که یک انتروتوکسین است و توکسین B که یک سیتوتوکسین می‏باشد.

·         تمام سویه‏های C.difficile  توکسین‏زا نیستند و حتی تمام سویه‏هایی که توکسین تولید می‏نمایند در صورتیکه تعدادشان کافی نباشد الزاماً سبب ایجاد بیماری نمی‏گردند.

·         آزمایش تشخیصی برای کولیت پسودوممبرانو، آنزیم ایمونواسی برای توکسین A و B می‏باشد.

·         کولیت ناشی از C.difficile می تواند منجر به ایجاد مگاکولون سمی و حتی مرگ بیمار گردد. در موارد بسیار شدید بیماری، ممکن است درمان دارویی کافی نبوده و نیاز به کولکتومی کامل باشد.

·         بهترین اقدام برای کولیت آنتی بیوتیکی، قطع سریع آنتی بیوتیک های وسیع الطیف (در صورت امکان) و جایگزینی آب و الکترولیت ها از راه وریدی (IV) و درمان آنتی بیوتیکی با مترونیدازول (فلاژیل)، یا ونکومایسین (ونکوسین) می باشد.

·         هیچ تست آزمایشگاهی وجود ندارد که به تنهایی تشخیص قطعی را امکان پذیر نماید.

·         از آزمایش های مرتبط برای تآیید  تشخیص می توان به آندوسکوپی، سیگموئیدوسکوپی و کشت مدفوع جهت بررسی باکتری های بی هوازی روده ای اشاره کرد.

          منابع :

1. کتاب جامع تست هاي تشخيصي و آزمايشگاهي پاگانا- دکتر مهتاب جعفر آبادي آشتياني و همکاران- نشر جامعه نگر
2. ميکروب شناسي تشخيصي- اصول تشخيص عفونت در ارگان هاي مختلف بدن، ترجمه و تأليف هما فروهش تهراني، سامان سعادت و زهرا ريخته گران تهراني
3. Jacobs S. D, DeMott R. W, Oxley K. D, Laboratory test handbook, 3 rd,Lexi comp,2004,pp:416-417
4. ARUP, Clostridium difficile Cytotoxin Cell Assay, Aruplaboratories; available at http://ltd.aruplab.com/Tests/Pub/0060851
5. Kit Catalog BIOSYNEX, IMMUNOQUICK^® TOXA/B a rapid test for the qualitative detection of toxin A&B in stool specimens. For professional in vitro diagnostic use only info@biosynex.com