نام اختصاری: LRT- S&C

سایر نام ها: اسمیر و کشت مجاری تحتانی تنفسی، اسمیر و کشت دستگاه تنفسی تحتانی، کشت باکتریهای هوازی ریوی، کشت و اسمیر خلط

Sputum Smear&Culture, Endotracheal Smear&culture, Bronchoalveolar Lavage (BAL), Transtracheal Aspirate (TTA). Aerobic Bacterial Culture, Respiratory, General Bacteria Culture, Sputum

بخش انجام دهنده: میکروب شناسی

نوع نمونه قابل اندازه گیری: خلط، ترشحات مجاری تنفسی تحتانی نظیر آسپیراسیون از طریق نای (TTA)، لاواژ برونش (BAL)، ساکشن اندوتراشه.

حجم نمونه مورد نیاز:  2ml

جمع آوری ، انتقال و آماده سازی نمونه:

نمونه لاواژ برونش (BAL)، آسپیره یا شستشوی برونش:

ظرف جمع آوری: ظرف استریل در پیچ دار

دستورالعمل های ویژه: کشت بی هوازی تنها زمانی امکان پذیر است که از کاتتر پوشش دار استفاده شده باشد.

شرایط انتقال به آزمایشگاه: ظرف 24 ساعت در دمای اتاق

شرایط نگهداری پیش از انجام آزمایش: 24 ساعت در 4^oC

محیط های اصلی کشت: بلاد اگار، شکلات آگار، مک کانکی

آزمایش میکروسکوپی: رنگ آمیزی گرم و در صورت درخواست، رنگ آمیزی های اختصاصی مانند آنتی بادی فلورسنت مستقیم برای لژیونلا و رنگ آمیزی اسیدفاست

سایر ملاحظات: کشت کمی برای BAL و باکتری های اسیدفاست، لژیونلا، نوکاردیا، مایکوپلاسما، پنوموسیستیس، سایتومگالوویروس.

نمونه خلط، آسپیره تراشه:

ظرف جمع آوری:  ظرف استریل در پیچ دار

آماده سازی بیمار: قبل از نمونه گیری خلط، بیمار مسواک زده و سپس با آب غرغره نماید.

دستورالعمل های ویژه: نمونه گیری خلط با سرفه عمیق انجام شود؛ کیفیت نمونه، با استفاده از رنگ آمیزی گرم مورد ارزیابی قرار گیرد؛ خلط حاصل از تحریک در کودکان به واسطه استفاده از سرم فیزیولوژی، ممکن است آبکی باشد.

شرایط انتقال به آزمایشگاه: ظرف 1 تا 3 ساعت در دمای اتاق

شرایط نگهداری پیش از انجام آزمایش: 1 تا 3 ساعت ( در مورد باسیل های اسیدفاست: 24 ساعت) در 4^oC

محیط های اصلی کشت: بلاد اگار، شکلات آگار، مک کانکی

آزمایش میکروسکوپی: رنگ آمیزی گرم و در صورت درخواست، رنگ آمیزی های اختصاصی مانند آنتی بادی فلورسنت مستقیم برای لژیونلا و رنگ آمیزی اسیدفاست

سایر ملاحظات: باکتریهای اسیدفاست، نوکاردیا

ملاحظات نمونه گیری:

1.  معمولی ترین نمونه ای که از بخش تحتانی مجرای تنفسی بدست می آید نمونه خلط است. بهترین نمونه خلط صبحگاهی می باشد که برای جمع آوری آن ابتدا بایستی دهان را با آب معمولی شسته و سپس با سرفه های عمیق خلط را در یک ظرف استریل دهان گشاد جمع آوری نمود.

2.  در صورتیکه بیمار قادر به خارج ساختن خلط نباشد با زدن به سینه بیمار و ورود ترشحات برونش به ریه و یا با خواندن مقداری محلول نمک غلیظ (سرم فیزیولوژی) بیمار را وادار به سرفه و در نتیجه خروج خلط می کنند.

3.  در بیماران مبتلا به سل ریوی که خلط تولید نمی کند می توان به وسیله سواب از حنجره یا شستشوی معده باسیل های سل را بدست آورد.

4.  در بیماران مبتلا به عفونت شدید ریوی که در کشت خلط خود دارای باکتریهای متعدد پاتوژن هستند برای جداسازی باکتری های بیماریزای مجاری تحتانی تنفسی می توان از آسپیراسیون نای و آزمایش میکروسکوپی و کشت خلط از محتویات آن استفاده نمود. از این روش نمونه برداری در مواردی که بیمار نتواند خلط بیرون دهد یا بیمار با باکتریهای بی هوازی یا میکروارگانیسم های غیر شایع (اختلالات ایمنی و آبسه ریوی) آلوده شده باشد استفاده می کنند.

5.  آسپیراسیون نای در اختلالات خونریزی دهنده، سرفه های غیر قابل کنترل و بیمارانی که همکاری ندارند ممنوع می باشد.

6.  . نمونه باید حداکثر 3-1 ساعت پس از جمع آوری مورد آزمایش و کشت قرار گیرد.

7.  منبع نمونه باید در برگه آزمایش ذکر گردد.

موارد عدم پذیرش نمونه:

ü      نمونه بدون برچسب یا با برچسب اشتباه

ü      نبودن نمونه یا کم بودن آن

ü      انتقال و نگهداری نامناسب نمونه

ü      نمونه گیری غلط از بیمار

کاربردهای بالینی: تشخیص علل عفونت مجاری تنفسی تحتانی. عفونتهای مجاری تنفسی تحتانی شامل برونشیت، آبسه های ریوی، پنومونی، برونکوپنومونی، سل ریوی و تورم پرده جنب می باشد.

 

·   پنومونی ویروسی: ویروس انفولانزا، آدنوویروس، سایتومگالوویروس، پاراانفولانزا، واریسلا زوستر، روبئولا، RSV و ویروس سندروم حاد تنفسی (SARS)

·   باسیل های گرم منفی هوازی: یرسینیا پستیس، فرانسیسلا تولارنسیس، بورخولدریا پسودومالئی، بروسلا، سالمونلا، کوکسیلا برونتی، باسیلوس آنتراسیس، پاستورلا مولتوسیدا

روش مرجع: کشت

سایر روشها: رنگ آمیزی به روش آنتی بادی فلورسنت مستقیم (DFA)، تست آنتی ژن ادراری سریع Binax NOW، تست های سرولوژی

مقادیر طبیعی: عدم رشد میکروارگانیسم یا رشد فلور نرمال در محیط کشت

تفسیر: :  تفسیر نتایج بر اساس یافته های آزمایش مستقیم و کشت می باشد.

آزمایش مستقیم: نمونه های مجرای تنفسی تحتانی را می توان با روش گسترش مرطوب (wet mount) برای برخی انگل ها و با روش های اختصاصی برای پنوموسیستیس مورد ارزیابی قرار داد. عناصر قارچی از طریق میکروسکوپ فازکنتراست و یا میکروسکوپ نوری با هیدروکسید پتاسیم 10%، تحت نور ماورای بنفش با کالکوفلور سفید، یا با استفاده از گستره های رنگ آمیزی شده با روش پریودیک اسید شیف قابل مشاهده خواهد بود.

خصوصیات ظاهری نمونه از لحاظ رنگ و حالت و همراه بودن با مواد غذایی باید گزارش شود. بطوریکه اگر رنگ های سبز، زرد، آجری و حالتهای بلغمی- چرکی، سفید-کف آلود مشاهده شوند باید گزارش گردد. برای تهیه لام مستقیم نمونه را به صورت wet mount بررسی می نماییم و با عدسی چشمی 10× مورد مطالعه میکروسکوپی قرار می دهیم. مشاهده بیش از 10 سلول اپی تلیال در هر میدان میکروسکوپی نشاندهنده آلودگی با نمونه دهانی است. نمونه هایی که بیش از 25 عدد گلبول سفید در هر میدان میکروسکوپی با عدسی 10× داشته باشند احتمالاً کشت مثبت دارند. ولی باید توجه داشت که بعضی از بیماران دارای لکوپنی در هر میدان عدسی 10× این میزان WBC  را ندارند. بطور کلی اگر بیش از 10 عدد WBC به ازای هر سلول اپیتلیال دیده شود نشانه جمع آوری مناسب نمونه است. ولی در هنگام رنگ آمیزی باید قسمتی از چرک یا مخاط یا خلط را برداشته و جهت رنگ آمیزی از نمونه خلط دو لام تهیه می شود که یکی به روش گرم و دیگری را در صورت لزوم و درخواست توسط پزشک به روش زیل نلسون رنگ آمیزی گردد. در چرک موجود در خلط افراد مبتلا به آسم معمولاً ائوزینوفیل وجود دارد که آن را می توان با رنگ آمیزی با یک رنگ مناسب هماتولوژیک نشان داد. برای اینکه کشت و اسمیر تهیه شده از خلط دارای ارزش تشخیصی باشد بهتر است که خلط را هموژنیزه نماییم.  

علاوه بر رنگ آمیزی گرم، نمونه های تنفسی ممکن است برای باسیل های اسید فست، با روش زیل نلسون کلاسیک (روش کربول فوشین کینیون) رنگ آمیزی گردند. رنگ های اورامین یا اورامین-رودامین هم برای تشخیص ارگانیسم های اسید فست مورد استفاده قرار می گیرند. این رنگ ها به دلیل خاصیت فلورسنت نسبت به روش کربول فوشین حساستر بوده و برای غربالگری سریع ارجح می باشند. روش های رنگ آمیزی اسید فست، گونه های کریپتوسپوردیوم را در صورتی که در دستگاه تنفسی وجود داشته باشند (در بیماران مبتلا به نقص ایمنی)، نشان خواهند داد. این بیماران اغلب در خطر عفونت با پنوموسیستیس کارینی قرار دارند. رنگ آمیزی تولوئیدن بلو O نه تنها پنوموسیستیس بلکه نوکاردیا آستروئیدس و برخی قارچ ها را نیز رنگ می کند. رنگ آمیزی با آنتی بادی منوکلنال یک روش بهینه رنگ آمیزی برای پنوموسیستیس کارینی، جهت نمونه های حاصل از روش های کم تهاجمی تری مثل BAL و خلط حاصل از تحریک محسوب می شود. رنگ آمیزی به روش آنتی بادی مستقیم (DFA) جهت تشخیص گونه های لژیونلا در نمونه های دستگاه تنفسی تحتانی مورد استفاده قرار گرفته است. خلط، مایع جنب، مواد تخلیه شده با سررنگ و بافت، نمونه های مناسبی هستند.

کشت: تمامی نمونه های خلط جهت جداسازی بهتر میگروارگانیسم های عامل بیماری، قبل از انجام کشت می بایست هموژنیزه شوند، زیرا مواد چرکی که حاوی اکثر پاتوژن ها می باشند با ترشحات موکوئیدی مخلوط هستند و اگر نمونه هموژنیزه نشود، جداسازی آنها با مشکل روبرو خواهد شد. در نمونه هموژنیزه هر قطره و یا یک لوپ پر از نمونه، حاوی پاتوژن های موجود در آن خواهد بود. جهت هموژنیزه کردن از مواد موکولایتیک استفاده می گردد. خلط با حجمی مساوی با ماده موکولایتیک (مانند دی تیوتریتول یا پانکراتین) به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق، بر روی شیکر مخلوط می گردد.

نمونه خلط هموژنیزه را روی محیط های بلاد آگار، شکلات آگار و مک کانکی کشت می دهیم. پلیت های کشت بلاد آگار و شکلات آگار باید در حضور CO₂ قرار گیرند. محیط بلاد آگار و مک کانکی جهت جداسازی و افتراق باسیل های گرم منفی از کوکسی های گرم مثبت و محیط شکلات آگار برای جداسازی هموفیلوس و گونه های نایسریا مورد استفاده قرار می گیرد. از آنجایی که پنوموکک و هموفیلوس آنفولانزا فلور نرمال حلق هستند بنابراین وجود آنها زمانی دارای ارزش می باشد که تعداد زیادی از آنها از نمونه جدا شوند. مشاهده بیش از 10 جفت دیپلوکوک گرم مثبت در لام مستقیم در هر میدان میکروسکوپی با عدسی 100×  نشاندهنده پنومونی پنوموکوکی است. نمونه های خلط بدست آمده از راه لاواژ و شستشوی برونش، آسپیره از نای و آسپیره از اندوتراشه یا تراکئوستومی به دلیل امکان آلودگی با فلور نرمال دهان در محیط های مایع غنی کننده کشت داده نشده یا بصورت بی هوازی انکوبه نمی گردند. تنها نمونه هایی مانند آسپیراسیون از راه نای و نمونه های به دست آمده به وسیله برونکوسکوپی با برس محافظت شده برونش برای کشت بی هوازی مفید می باشند؛ کشت نمونه اخیر به منظور تفسیر صحیح، بایستی به صورت کمی انجام گیرد. فقط نمونه های حاصل از آسپیراسیون از راه نای را می توان علاوه بر محیط های جامد، در تایوگلایکولات نیز کشت داد. موارد مشکوک به بیماریهای لژیونلایی، در محیط های آگار BCYE کشت داده می شوند. کلنی های لژیونلا پس از 3 تا 5 روز انکوباسیون در دمای 35 درجه سانتی گراد، بر روی آگار انتخابی تشکیل می شوند. نمونه های خلط بیماران مبتلا به سیستیک فیبروزیس باید در آگار انتخابی، مانند مانیتول سالت آگار جهت جداسازی استافیلوکوکوس ارئوس و محیط انتخابی حاوی خون اسب و باسیتراسین جهت جداسازی هموفیلوس انفولانزا کشت داده شوند. استفاده از محیط های انتخابی برای بورخولدریا سپاسیا مانند محیط های PC یا OFPBL آگار نیز ضرورت دارد. جهت تفسیر  نتایج کشت نمونه های آلوده شده با فلور نرمال اوروفارنکس ( به عنوان مثال در خلط حاصل از سرفه یا تحریک و شستشوی برونش) رشد غالب باکتری های بی هوازی گوناگون و باکتری های هوازی گزارش می شود. ارزش بالینی یافته های حاصل از کشت نه تنها به روش های آزمایشگاهی مناسب و استاندارد، بلکه به چگونگی جمع آوری و انتقال نمونه ها، سایر داده های آزمایشگاهی و تظاهرات بیمار بستگی دارد.

محدودیت ها و عوامل مداخله گر :

§         هیچ تست اختصاصی که بتواند تمام پاتوژن های بالقوه دستگاه تنفسی را شناسایی کند در دسترس نیست.

§         با وجود آنکه تشخیص سریع میکروارگانیسم عامل بیماری اهمیت زیادی در کنترل پونمونی دارد، اما عامل بیماری در 50% بیماران حتی با وجود تست های تشخیصی گسترده، تعیین نمی گردد.

§         به دست آوردن نمونه خلط خوب به آموزش کامل کارکنان مربوطه و درک بیمار از تمام مراحل مرتبط با روند جمع آوری نمونه بستگی دارد.

§         تمامی نمونه های خلط جهت جداسازی بهتر میگروارگانیسم های عامل بیماری، قبل از انجام کشت می بایست هموژنیزه شوند، زیرا مواد چرکی که حاوی اکثر پاتوژن ها می باشند با ترشحات موکوئیدی مخلوط هستند و اگر نمونه هموژنیزه نشود، جداسازی آنها با مشکل روبرو خواهد شد.

§         نمونه های مربوط به آسپیره یا شستشوی برونش، نمونه های لاواژ برونش (BAL)، نمونه های بدست آمده توسط برس حفاظ دار برونش یا نمونه های مربوط به بیوپسی از راه برونش، طی برونکوسکوپی توسط پزشک نمونه برداری می گردند.

§         آسپیراسیون از طریق نای (TTA)، نباید در مورد بیماران با سیستم ایمنی ضعیف، بیماران مستعد خونریزی یا بیمارانی که اکسیژن کافی دریافت نمی کنند، استفاده گردد.

§         روش رنگ آمیزی تغییر یافته Gomori methenamine silver به صورت سنتی جهت شناسایی نوکاردیا، اکتینومایسس، قارچ ها و انگل ها بکار گرفته می شد، اما فرایند انجام آن حدود 1 ساعت به طول می انجامد، به لحاظ تکنیکی دشوار بوده و در موارد اورژانس مناسب نمی باشد.

§         به خاطر حساسیت پایین رنگ آمیزی به روش آنتی بادی فلورسنت مستقیم (DFA) نباید به جای کشت به نتایج DFA اعتماد نمود.

§         عوامل باکتریایی فراوانی که موجب عفونت های دستگاه تنفسی تحتانی هستند از طریق کشت های باکتریولوژیک معمول قابل شناسایی نمی باشند. مایکوباکتریوم ها، کلامیدیا، نوکاردیا، بردتلا پرتوزیس، لژیونلا و مایکوپلاسما پنومونیه به روش های اختصاصی برای شناسایی نیاز دارند. این نیاز درباره ویروس ها و قارچ ها نیز وجود دارد.

توضیحات:

·         عوامل باکتریایی فراوانی که موجب عفونت های دستگاه تنفسی تحتانی هستند از طریق کشت های باکتریولوژیک معمول قابل شناسایی نمی باشند. مایکوباکتریوم ها، کلامیدیا، نوکاردیا، بردتلا پرتوزیس، لژیونلا و مایکوپلاسما پنومونیه به روش های اختصاصی برای شناسایی نیاز دارند؛ این نیاز درباره ویروس ها و قارچ ها نیز وجود دارد.

·         عوامل بالقوه مرتبط با حملات بیوتروریستی، از جمله باسیلوس آنتراسیس، فرانسیسلا تولارنسیس و یرسینیا پستیس امکان دارد از دستگاه تنفسی جدا گردند.

·         در میان عوامل بیماریزای قارچی، هیستوپلاسما کپسولاتوم، بلاستومایسس درماتیتیدیس، پاراکوکسیدیوئیدس برازیلینسیس، کوکسیدیوئیدس ایمیتیس، کریپتوکوکوس نئوفرمنس و گاه آسپرژیلوس فومیگاتوس ممکن است پنومونی حاد ایجاد نمایند. بنابراین تاریخچه شغلی و سابقه تماس با حیوانات در پیش بینی عوامل بالقوه عفونی خاص اهمیت دارد.

·         برونشیت حاد به التهاب حاد انشعابات نای و برونش اطلاق م شود. این شرایط ممکن است حاصل یک عفونت ویروسی دستگاه تنفسی فوقانی مانند انفولانزا یا یک سرماخوردگی عادی باشد. اغلب عفونت ها طی زمستان، زمانی که عفونت های دستگاه تنفسی شایعند، اتفاق می افتند. یک عامل باکتریایی مهم در شیرخوران و کودکان پیش دبستانی، بردتلا پرتوزیس (عامل سیاه سرفه) می باشد. بهترین نمونه برای تشخیص سیاه سرفه سوآب عمقی از نازوفارنکس است.

·         برونشیت مزمن بیماری شایعی است که حدود 10 تا 25% بزرگسالان را درگیر می کند. استعمال سیگار، عفونت، استنشاق گرد و غبار یا دود از عوامل مهم محسوب می گردند. برونشیت مزمن ممکن است به فرم حاد تبدیل شود، اما تعین علت عفونت در این موارد دشوار است. باکتری های بالقوه پاتوژن، مانند سویه های فاقد کپسول هموفیلوس انفولانزا، استرپتوکوکوس پنومونیه و مورکسلا کاتارالیس، مکرراً از ترشحات برونش این بیماران جدا می شوند.

·         برونشیولیت یا التهاب سلول های اپی تلیال برونشیول، یک عفونت حاد ویروسی دستگاه تنفسی تحتانی است که عمدتا طی دو سال ابتدایی زندگی رخ می دهد. ویروس سنسیشیال تنفسی (RSV) علاوه بر بروز فصلی مشخص، عامل 40% تا 80% موارد برونشیولیت می باشد.

·         پنومونی یا التهاب دستگاه تنفسی تحتانی با درگیری مجاری هوایی ریوی و ساختار های جانبی آن گفته می شود و به دو نوع پنومونی بیمارستانی و غیر بیمارستانی تقسیم می گردد. پنومونی بیمارستانی عمدتاً ناشی از عفونت مرتبط با دستگاه تنفس مصنوعی به دنبال لوله گذاری و بیماران بستری تحت مراقبت های وِزه بیمارستانی در نتیجه استفاده طولانی مدت از تجهیزات درمانی ایجاد می گردد. عفونت پس از یک دوره بستری 48 تا 72 ساعته رخ می دهد.

·         شایعترین عامل ایجاد پنومونی در نوزادان کلامیدیا تراکوماتیس یا پنوموسیستیس کارینی می باشد. در بیماران 2 ماهه تا 5 ساله RSV، متاپنوموویروس انسانی، پاراآنفولانزا، انفولانزا و آدنوویروس ها شایعترین عوامل پنومونی می باشند. مایکوپلاسما پنومونیه و کلامیدوفیلا پنومونیه رایج ترین علل پنومونی باکتریایی در کودکان 5 تا 14 ساله به شمار می روند. شایعترین عامل عفونت دستگاه تنفسی تحتانی در میان جوانان کمتر از 30 سال، مایکوپلاسما پنومونیه می باشد که انتقال آن از ریق تماس نزدیک صورت می گیرد. استرپتوکوکوس پنومونیه شایع ترین عامل پنومونی باکتریایی در بزرگسالان از جامعه را به خود اختصاص می دهد.

·         متداول ترین پنومونی ناشی از آسپیراسیون ترشحات دهانی یا معده ای باکتری های بی هوازی نظیر گونه های پورفیروموناس و پرووتلا، باکتروئیدس گراسیلیس، فوزوباکترها و استرپتوکک های میکروآئروفیل می باشند. همچنین استافیلوکوکوس ارئوس، انواع انتروباکتریاسه، هموفیلوس آنفولانزه، کلامیدوفیلا پنومونیه، مورکسلا کاتارالیس، گونه های لژیونلا، اسینتوباکتر، مننگوکک و سودوموناس ممکن است از طریق آسپیراسیون ترشحات وارد ریه شوند.

·         پس از ابتلا به پنومونی ویروسی، مخصوصاً انفولانزا، احتمال بیماری باکتریایی ثانویه بر اثر استرپتوکک های بتا همولیتیک، پنوموکک، استافیلوکوس ارئوس، مورکسلا کاتارالیس، هموفیلوس انفولانزا و کلامیدوفیلا پنومونیه افزایش می یابد. از دیگر عواملی که می توانند در ارتباط با موقعیت جغرافیایی و تظاهرات بالینی مورد توجه قرار گیرند ویروس های متعلق به جنس هانتاویروس هستند، که رایج ترین آنها ویروسی است که به عنوان عامل سندروم حاد تنفسی (SARS) مطرح می باشد.

·         مایکوباکتریوم توبرکلوزیس محتمل ترین عامل مسبب عفونت مزمن دستگاه تنفسی تحتانی (سل ریوی) است، اما عفونت های قارچی و بی هوازی ریوی نیز ممکن است سیر مزمن یا تحت حاد پیدا کنند. مایکوباکتریوم آویوم اینتراسلولار و مایکوباکتریوم کانزاسی هم ممکن است چنین وضعیتی را ایجاد نمایند. اکتینومایسس و نوکاردیا نیز ممکن است با بروز تدریجی علائم بیماری همراه باشند. اکتینومایسس عموماً با عفونتی در پرده جنب یا قفسه سینه همراه است و نوکاردیا را می توان طی عفونت ناشی از مایکوباکتریوم توبرکلوزیس جدا نمود.

·         سیستیک فیبروزیس یک اختلال ژنتیکی است که به عفونت باکتریایی ماندگار در ریه ها  می انجامد، این بیماری باعث صدمه به جدار مجاری هوایی و انسداد مزمن ریوی می شود. بیماران مبتلا به سیستیک فیبروزیس ممکن است به عفونتهای حاصل از سودوموناس آئروژینوزا، استافیلوکوکوس ارئوس، هموفیلوس انفولانزه و کمپلکس بورخولدریا سپاسیا مبتلا شوند. RSV، انفولانزا A، مایکوباکتریوم های غیر توبرکلوئیدی و آسپرژیلوس نیز در این افراد به عنوان پاتوژن های مهم مطرح می باشند.

          منابع :

1.  کتاب جامع تجهيزات آزمايشگاهي و فرآورده هاي تشخيصي- دکتر حميد رضا سقا و همکاران- نشر مير

2.  ميکروب شناسي تشخيصي، اصول تشخيص عفونت در ارگان هاي مختلف بدن، ترجمه و تأليف هما فروهش تهراني، سامان سعادت و زهرا ريخته گران تهراني.انتشارات ابن سینا

3.  سايت مايو کلنيک (Mayo mediacal laboratories): http://www.mayomedicallaboratories.com/test-catalog/Overview/8095

4. Baily & Scott's Diagnostic Microbiology,12 edition,ISBN 13978-0-323-03065-6, MOSBY