نام اختصاری: JAK₂ PCR

سایر نام ها:

JAK2 V617F Mutation Detection ،Tyrosine kinase mutationmutation, Janus kinase 2 gene

بخش انجام دهنده: بیولوژی مولکولی (Department of Molecular Biology)

نوع نمونه قابل اندازه گیری: خون محیطی

حجم نمونه مورد نیاز: خون تام (whole blood) 5 ml

شرایط نمونه گیری:

1.       نیاز به ناشتایی نمی باشد.

2.       نمونه گیری باید در شرایط استریل انجام شود.

ملاحظات نمونه گیری:

1.              از ظرف های مخصوص و یکبار مصرف برای جمع آوری نمونه استفاده شود.

2.              برای جمع آوری خون از لوله های استریل حاوی ماده ضد انعقاد EDTA یا سیترات استفاده شود.

3.              پس از نمونه گیری باید سرنگ و سر سرنگ در یک سطل ایمنی (Safety Box) جمع آوری گردیده و سپس سوزانده شود.

4.          پس از گرفتن نمونه خون باید لوله حاوی نمونه سانتریفیوژ شود و در ادامه پس از دور ریختن پلاسما، بافی کت طبق دستورالعمل جداسازی بافی کت جدا شده و به حجم های کوچک تقسیم شود و سپس در فریزر قرار گیرد و تا انجام مراحل بعدی که مربوط به استخراج DNA و PCR می باشد، در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری شود.

5.          نمونه مناسب باید حاوی یک تا 10 میلیون گلبول سفید در هر 200 میکرولیتر باشد.

6.              محل نمونه گیری از لحاظ خونریزی بررسی شود.

7.              در صورت نمونه گیری در خارج از آزمایشگاه، نمونه باید در شرایط خنک و طی کوتاه ترین زمان ممکن به آزمایشگاه ارسال شود (خون کامل را می توان حداکثر تا 72 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری کرد ولی برای نگهداری نمونه در زمان های طولانی تر لازم است از روشی که در شماره 4 همین بند توضیح داده شد، تبعیت شود).

8.              سطوح کار باید همواره قبل از شروع و پس از پایان کار با دستمال آغشته به الکل 70% و یا وایتکس10% تمیز شود.

موارد عدم پذیرش نمونه:

1.       جمع آوری نمونه ها در شرایط غیر استریل.

2.       سرم، نمونه های فریز شده، نمونه های منعقد شده یا به شدت همولیز شده.

3.       نمونه های جمع آوری شده در ظروف حاوی مواد ضد انعقاد غیر از EDTA (هپارین با غلظت بیش از 10 واحد در میلی لیتر سبب مهار PCR می شود لذا، از نمونه های هپارینه و نیز نمونه بیماران تحت درمان با هپارین نمی توان استفاده کرد).

شرایط نگهداری:

1.       طی چند ساعت اولیه پس از نمونه گیری باید بافی کت نمونه های مورد استفاده جداسازی شده و به حجم های مورد نیاز تقسیم شود و در دمای20- درجه سانتیگراد قرار داده شود و از ذوب و فریز مکرر آنها تا زمان انجام مراحل بعدی آزمایش خودداری شود.

2.       جهت حمل و نقل نمونه لازم است نمونه در شرایط خنک حمل شود ولی باید از یخ زدگی آن جلوگیری نمود.

3.       خون کامل را می توان حداکثر تا 72 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری و به آزمایشگاه منتقل کرد.

کاربردهای بالینی:

ü    سرعت و حساسیت بالای تشخیص اختصاصی الل جهش یافته

ü    در دسترس بودن و سادگی نمونه مورد نیاز (5 میلی لیتر خون محیطی جهت انجام این تست کافی است)

ü    کمک به تمایز میان یک راکتیو سایتوزیس با یک اختلال مزمن میلوپرولیفریتیو

اطلاعات تکمیلی:

اختلالات میلوپرولیفرتیو (MPD) در انسان به گروهی از مسائل خونی مربوط می شود که طی آن یک اختلال اولیه در سطح سلول های بنیادی کلونال در نهایت به افزایش تولید یک یا چند نوع سلول خونی منتهی می شود و شامل انواع پلی سیتمی ورا (PV)، ترومبو سیتمی اساسی (ET)، میلوفیبروزیس ایدیوپاتیک (IMF) و لوسمی میلوئیدی مزمن (CML) می باشد. اولین نشانه های PV و ET افزایش تولید گلبول های قرمز خونی است که به تظاهرات بالینی ترومبوز یا خونریزی منتهی می شود و پیشرفت بیماری می تواند در ادامه منجر به ایجاد IMF شود که خود با فیبروز مغز استخوان، سیتوپنی و اسپلنومگالی (بزرگ شدن طحال) همراه است و معمولاً فرد مبتلا کمتر از 5 سال زنده می ماند.

در سال 2005 چند گروه تحقیقاتی به صورت مستقل از هم، وجود ارتباط میان جهش نقطه ای در ژن
JAK₂ (Janus Kinase 2) واقع در کروموزوم 9 را با بیماران مبتلا به PV و ET و IMF شناسایی کردند. JAK₂ معرف یک تیروزین کیناز است که در سیتوپلاسم واقع شده و نقش مهمی در انتقال پیام های سیتوکین ها و هورمون های رشد دارد. جهش در اثر جایگزینی یک تیمین به گوانین در نوکلئوتید 1849 (G1849T) اگزون 14 رخ می دهد که در نتیجه آن اسید آمینه والین در موقعیت 617 زنجیره پلی پپتیدی به فنیل آلانین (V617F) تبدیل می شود. در نتیجه این موتاسیون، JAK₂ به صورت دائمی فعال شده و موجب رشد مهار نشده سلول در غیاب هورمون های رشد می شود. این موتاسیون در اکثر بیماران دچار اختلالات میلوپرولیفریتیو کهBCR – ABL  منفی می باشند، مشاهده می شود و به عنوان یکی از ابزار های مهم تشخیصی برای بیماران پلی سیتمی ورا (PV)، ترومبوسیتمی اساسی (ET) و میلوفیبروزیس اولیه (PMF) محسوب می شود.

روش مرجع: Real Time PCR

روش ارجح: ردیابی جهش نقطه ای بااستفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز به روش Real Time (Real Time PCR)

سایر روشها: انواع روش های مبتنی بر PCR نظیر:

AS PCR (Allele Specific PCR), ARMS PCR (Amplification Refractory Mutation System PCR),
RT PCR, PCR-Restriction Analysis, Genomic DNA-PCR Sequencing

 

مقادیر طبیعی:DNA  جهش یافته در نمونه های حاصل از افراد سالم قابل ردیابی نیست.

محدوده قابل سنجش: در صورتی که از مقادیر مناسب و کافی DNA استفاده شود، حساسیت تشخیصی تست PCR معادل0.001 درصد (یک در ده هزار) می باشد. برای تهیه مقادیر کافی از DNAی مورد نظر، باید DNAی ژنومی حاصل از 100000 سلول را استخراج نمود که این مقدار DNA در نتیجه استخراج 5 تا 10 میلیون گلبول سفید و حل کردن DNAی حاصل در 200 میکرولیتر بافر حاصل می شود.

تفسیر:

اختلالات میلوپرولیفراتیو (MPD) یک گروه ناهمگن از بیماری های خونی هستند، که با تکثیر کلونال سلول ها، جهش های سوماتیک و اختلالات چند رده ای سلول های خونی مشخص می شوند. مطالعات نشان داده اند که جهش نقطه ای در ژن JAK₂ (جانوس کیناز 2) در بیش از 95% از بیماران مبتلا بهPV  (پلی سیتمی ورا)، 60% از بیماران مبتلا به ET (ترومبوسیتمی اساسی) و در حدود 50% از بیماران مبتلا به IMF (میلوفیبروزیس ایدیوپاتیک) یافت می شود.

تشخیص جهش JAK2 تشخیص افتراقی قابل اعتمادی را برای سایر انواع اختلالات پلی سیتمیک مادرزادی، اکتسابی و ایدیوپاتیک، افزایش پلاکت غیر قابل توضیح و فیبروز مغزاستخوان با منشاء نامشخص فراهم می کند همچنین آنالیز جهش به عنوان معیار اصلی افتراق میان بیماریهای PV،ET  و IMF پیشنهاد شده است و امکان بررسی پیشرفت بیماری را به ما می دهد.

در حال حاضر روش Real time PCR به عنوان یکی از دقیق‌ترین و سریع ترین روش‌ها جهت شناسایی جهش‌های نقطه‌ای نظیر جهش V617F محسوب می شود. در روشReal Time PCR   از پروپ‌های هیبریدی استفاده می شود که این پروپ‌ها به طور اختصاصی به ناحیه جهش یافته متصل می‌شوند و با ارسال سیگنال‌های فلورسانس امکان شناسایی توالی های نرمال و جهش یافته را ممکن می‌سازند. در این آزمایش نمونه DNA فرد بیمار به همراه چندین کنترل از جمله کنترل مثبت و منفی برای جهش V617F، یک نمونه مرجع و یک کنترل Blank  مورد استفاده قرار می گیرد و نتایج با کمک نرم افزار و اندازه گیری میانگین نسبت سیگنال‌های فلورسانس ناشی از پروپ موتان و طبیعی ارزیابی می‌شوند.

 

عوامل مداخله گر :

·         هپارین در مقادیر بالا در این آزمایش تداخل ایجاد می کند.

·         نمونه گیری، جداسازی بافی کت و انجام سایر مراحل آزمایش در شرایط غیر استریل می تواند منجر به ایجاد نتایج مثبت کاذب گردد.

·         برای جلوگیری از ایجاد نتایج مثبت کاذب باید فضاهای مربوط به استخراج DNA، آماده سازی مواد مورد نیاز واکنش و فضای افزودن نمونه DNA به لوله PCR از هم جدا باشند.

توضیحات:

·         نتیجه «Undetected» نشان می دهد که نوع جهش یافته DNA درنمونه یافت نشده است.

·         نتیجه مثبت تشخیص اختلال میلوپرولیفراتیو را تائید می کند.

·         نتیجه منفی امکان وجود جهش در ژن JAK₂  و احتمال تشخیص PV، ET و یا IMF را رد نمی کند. چرا که فاکتورهایی همچون تجزیه اسید نوکلئیک یا تداخل بعضی از مواد با آمپلیفیکاسیون ممکن است وجود داشته‌ باشد.

منابع :

1.     سایت مایو کلنیک:http://www.mayomedicallaboratories.com/test-catalog/Overview/88715

2.     کیت تشخیص JAK2، جهت تشخیص موتاسیونJAK2 (V617F) به روش Real – Time PCR، نوین ژن.

3.     فایل ضمیمه:

 http://www.aruplab.com/Testing-Information/resources/TechnicalBulletins/JAK2%20c.1849G-T%20(V617F)%20Mutation%20Quantification%20by%20Real-Time%20PCR%20-%20March%202007.pdf

 

4.        Donal McLornan, Melanie Percy, and Mary Frances McMullin, JAK2 V617F: A Single Mutation in the Myeloproliferative Group of Disorders, Ulster Med J. May 2006; 75(2): 112–119.

5.        Mamdooh A. Gari, The Role of Janus Kinase 2 (JAK2) in the Pathologenesis of Myeloproliferative Disorders,  JKAU: Med. Sci., Vol. 16 No. 1, pp: 3-19 (2009A.D. / 1430 A.H.)