نام اختصاری: HSV PCR  

سایر نام ها: تشخیص HSV به روش Real-Time PCR

HSV DNA Detection, Herpes Simplex Virus Detection by Real-Time PCR, Real-Time Polymerase Chain Reaction (PCR)

بخش انجام دهنده: بیولوژی مولکولی (Department of Molecular Biology)

نوع نمونه قابل اندازه گیری:

نمونه مورد نیاز می تواند یکی از موارد ذیل باشد:

سرم یا پلاسما، ادرار، مایعات بدن نظیر نخاعی (CSF)، آمنیوتی و چشمی، نمونه تناسلی نظیر نمونه تهیه شده از سرویکس، واژن و یا سایر بخش های تناسلی، نمونه های تنفسی نظیر ترشحات برونش، نازوفارنکس و نایی، BAL و بزاق، بافت های مختلف نظیر مغز، کولون، کلیه، کبد، ریه و غیره و یا سایر نقاط بدن که درگیر عفونت ویروسی شده اند، نظیر پوست، بینی، گلو و غیره.

حجم نمونه مورد نیاز:

ü     5 ml  ترشحات ریوی، ادرار و خون،

ü      1ml  سرم، پلاسما و مایعات بدن،

ü      نمونه های تناسلی و نمونه های حاصل از زخم یک سواب.

شرایط نمونه گیری:

1.       نیاز به ناشتایی نمی باشد.

2.       نمونه گیری باید در شرایط استریل انجام شود.

ملاحظات نمونه گیری:

1.              از ظرف های مخصوص و یکبار مصرف برای جمع آوری نمونه استفاده شود.

2.              برای جمع آوری خون یا پلاسما از لوله های استریل حاوی ماده ضد انعقاد استفاده شود.

3.              ماده ضد انعقاد مورد نیاز برای جمع آوری خون یا پلاسما می تواند EDTA یا سیترات باشد.

4.              پس از نمونه گیری باید سرنگ و سر سرنگ در یک سطل ایمنی (Safety Box) جمع آوری گردیده و سپس سوزانده شود.

5.          پس از گرفتن نمونه خون باید لوله حاوی نمونه سانتریفیوژ شود و در ادامه پس از جدا سازی سرم یا پلاسما، بلافاصله نمونه در فریزر قرار گیرد و تا انجام مراحل بعدی که مربوط به استخراج DNA و PCR می باشد، در ºC20 – نگهداری شود.

6.              محل نمونه گیری از لحاظ خونریزی بررسی شود.

7.              در صورت نمونه گیری در خارج از آزمایشگاه، نمونه باید در شرایط خنک و سرد و طی کوتاه ترین زمان ممکن به آزمایشگاه ارسال شود.

8.              سطوح کار باید همواره قبل از شروع و پس از پایان کار با دستمال آغشته به الکل 70% و یا وایتکس 10% تمیز شود.

موارد عدم پذیرش نمونه:

1.       نمونه گیری نادرست و در شرایط غیر استریل.

2.        قرار دادن نمونه در درجه حرارت بالا و ذوب و فریز مکرر نمونه.

3.        در این آزمایش از نمونه های هپارینه نمی توان استفاده کرد (هپارین با غلظت بیش از 10 واحد در میلی لیتر سبب مهار PCR می شود). همچنین نمونه بیماران تحت درمان با هپارین نیز برای PCR مناسب نیست.

شرایط نگهداری:

1.       سرم یا پلاسما باید طی چند ساعت اولیه پس از خون گیری جدا سازی شده و تا زمان انجام  آزمایش، در دمای ºC 20- نگهداری شود. سایر نمونه های مورد استفاده نیز باید طی چند ساعت اولیه پس از نمونه گیری در دمای ºC 20-  قرار داده شده و از ذوب و فریز مکرر آنها تا زمان انجام مراحل بعدی آزمایش خودداری شود.

4.        جهت حمل و نقل نمونه لازم است نمونه در شرایط سرد حمل شود.

5.       در صورت نبود شرایط برای انتقال نمونه در 24 ساعت اولیه، نمونه را در ^oC 20-  فریز نمایید.

کاربردهای بالینی:

تشخیص زود هنگام عفونت ویروسی و اقدام برای درمان به موقع بیماری، بدون آن که نیاز به بیوپسی مغز باشد (در صورت بروز آنسفالیت ویروسی، تشخیص سریع عفونت ویروسی، برای مدیریت بیماری و شروع به موقع درمان و کاهش تلفات الزامی است).

اطلاعات تکمیلی:

ویروس های هرپس سیمپلکس از خانواده هرپس ویروس ها می باشند که به فراوانی در جوامع انسانی پراکنده اند. این ویروس ها، میزبان های زیادی داشته و قادرند در انواع مختلفی از سلول ها تکثیر یافته و حیوانات مختلفی را آلوده نمایند. تمام هرپس ویروس ها دارای یک هسته مرکزی از زنجیره مضاعف DNA مارپیچی هستند که با یک کپسید پروتئینی با تقارن بیست وجهی احاطه شده اند.

ویروس هرپس سیمپلکس عامل عفونت های بسیار متنوعی است که معمولاً در بزرگسالان فاقد علائم بالینی واضح می باشند. پس از عفونت اولیه، ویروس به صورت عفونت مخفی تا پایان عمر در عقده های عصبی حسی و خود مختار باقی می ماند. عوامل متعددی از جمله استرس می توانند سبب فعال شدن ویروس شوند. در پی فعال شدن ویروس امکان انتقال آن از طریق آکسون ها به سیستم عصبی مرکزی و ایجاد عفونت در آنجا نیز وجود دارد. این پدیده سبب می شود که ویروس هرپس سیمپلکس به عنوان مهم ترین عامل انسفالیت ویروسی شناخته شود. 33 درصد بزرگسالانی که مبتلا به انسفالیت هرپسی می‌شوند عفونت اولیه دارند. نوزادانی که در حین عبور از کانال تولد آلوده می‌شوند ممکن است درگیری پوست، چشم و غشاهای مخاطی را داشته باشند که منجر به انتشار گسترده و انسفالیت می‌شود.

دو تیپ متفاوت 1 و 2 از ویروس هرپس سیمپلکس وجود دارد. هر کدام از این دو ویروس چندین پروتئین خاص دارند با این حال، در تست های سرولوژی با هم واکنش متقاطع می دهند که این امر تشخیص آنها از یکدیگر را دشوار می سازد. تشکیلات ژنوم دو تیپ ویروسی به هم شبیهند و توالی مشابهی در DNA دارند ولیکن، با استفاده از تکنیک های تشخیص مولکولی می توان آنها را از هم تشخیص داد. همچنین کشت HSV معمولاً در انسفالیت هرپسی منفی است، و این در حالی است که، روشPCR  حساسیت بالایی نسبت به کشت داشته و می توان از آن به عنوان روش تشخیصی غیرتهاجمی استفاده نمود. بیوپسی مغز همراه با کشت و هیستوپاتولوژی در تشخیص انسفالیت هرپسی جهت رد کردن سندرم‌های بالینی مشابه انسفالیت هرپسی مفید می‌باشد ولیکن، مطالعات متعدد توانایی PCR جهت ردیابی و شناسایی DNA ویروس هرپس سیمپلکس را در مواقعی که نتایج کشت منفی هستند اثبات کرده‌اند. 

روش مرجع: ردیابی مولکولی DNA ویروس هرپس سیمپلکس

روش ارجح: ردیابی ژنوم ویروس به وسیله واکنش زنجیره ای پلیمراز

سایر روشها: کشت ویروس، ردیابی آنتی ژن های ویروسی، تست های سرولوژیکی، روش‌های مولکولی غیر از PCR شامل  Capture Hybrid و هیبریداسیون درجا.

مقادیر طبیعی:  DNA ویروس  HSV در نمونه های حاصل از افراد سالم قابل ردیابی نیست.

محدوده قابل سنجش:  250 – 2500000 HSV DNA copies/mL

تفسیر:

هم چنان که پیشتر ذکر شد، روش های مبتنی بر کشت HSV و روش های سرولوژیکی جهت تشخیص عفونت ویروسی در بیماران چندان کارامد نبوده و این مسأله می تواند در مبتلایان به انسفالیت ویروسی عواقب جدی به همراه داشته باشد. لذا روشهای مبتنی بر PCR، به عنوان بهترین روش جهت تشخیص به موقع و انجام اقدامات درمانی مناسب شناخته شده است.

ردیابی پاتوژن به وسیله PCR بر اساس تکثیر نواحی اختصاصی از ژنوم ویروس صورت می گیرد. در حال حاضر روش Real time PCR در مقایسه با سایر روش های ارزیابی میزان ویروس دارای بیشترین حساسیت و وسیع ترین دامنه اندازه گیری است. در این روش محصول تکثیر یافته از طریق رنگ های فلوئورسنت ردیابی می شود که این امر عموماً  به واسطه پروب های الیگونوکلئوتیدی که به طور اختصاصی به محصول تکثیر یافته متصل می شوند، صورت می گیرد. مشاهده مستقیم شدت فلوئورسانس در طول PCR (یعنی real time)، به ما اجازه می دهد تا بدون نیاز به باز کردن مجدد تیوب ها بعد از اتمام PCR، محصول جمع شده را ردیابی نموده و کمیت آن را نیز تعیین نمائیم.

عوامل مداخله گر :

·         هپارین در مقادیر بالا در این آزمایش تداخل ایجاد می کند.

·         نمونه گیری و جداسازی پلاسما یا سرم در شرایط غیر استریل می تواند منجر به ایجاد نتایج مثبت کاذب گردد.

·         فضاهای مربوط به استخراج DNA، آماده سازی مواد مورد نیاز واکنش و فضای افزودن نمونه DNA به لوله PCR، برای جلوگیری از ایجاد نتایج مثبت کاذب باید از هم جدا باشند.

توضیحات:

·         نتیجه «Undetected»  نشان می دهد که DNA ویروس در نمونه یافت نشده است.

·         نتایج کمی بیان شده به واحد copy/ml  نشان دهنده میزان فعالیت ویروس و تکثیر آن در بیمار است.

·         نتایج کمی بر پیشرفت بیماری در عفونت HSV و یا پاسخ به درمان ضد ویروسی نظارت می کند.

·         تشخیص عفونت با حضور مقادیر قابل تشخیص و سنجش DNA  ویروس در نمونه مورد آزمایش امکان پذیر است.

·         در صورت عدم ردیابی DNA ویروس در نمونه بیمار، احتمال آلودگی به ویروس رد نمی گردد چرا که فاکتورهایی همچون تجزیه اسیدنوکلئیک یا تداخل بعضی از مواد با آمپلیفیکاسیون ممکن است وجود داشته ‌باشد.          

منابع :

1.     سایت مایو کلنیک: http://www.mayomedicallaboratories.com/test-catalog/Specimen/80575.

2.     میکروبیولوژی پزشکی جاوتز، گنو اف. بروکس، ت مهدی خزعلی، نشر حیان، 2004 ISBN: 964-460-800-3

3.     کیت HSV 1/2 RG جهت تشخیص و کمیت سنجی ویروس هرپس سیمپلکس تیپ 1 و 2 به روش Real – Time PCR، Novin Gene

4.        artus, HSV – 1/2 RG PCR Kit Handbook, QIAGEN

5.        http://labmed.yale.edu/virology/71_2383_Newsletter16_2.pdf

6.        Harald H. Kessler, Gerhard Mühlbauer, Beate Rinner, Evelyn Stelzl, Annemarie Berge, Hans-Wilhelm Dörr, Brigitte Santner, Egon Marth and Holger Rabenau. (2014), Detection of Herpes Simplex Virus DNA by Real-Time PCR. Clinical Microbiology, Volume 52, Issue 8.

7.        http://lab.behdasht.gov.ir/test/printTest/205.