Quantitative Fluorescence-Polymerase Chain Reaction (QF-PCR)

نام اختصاری:QF-PCR

سایر نام ها:

*        quantitative fluorescence PCR (QF-PCR)

*        quantitative PCR of Short Tandem Repeats

بخش انجام دهنده: ژنتیک

نوع نمونه قابل اندازه گیری:آمنیون و پرز کوریونی و خون محیطی

حجم نمونه مورد نیاز: خون تام (whole blood) 5 میلی لیتر و حداقل 5 میلی لیتر مایع امنیون

شرایط نمونه گیری:

1.      نیاز به ناشتایی یا آمادگی خاصی نمی باشد.

2.      نمونه گیری باید در شرایط استریل انجام شود.

3.      نمونه آمنیون باید عاری از هر گونه آلودگی با خون مادری باشد.

ملاحظات نمونه گیری:

خون:

1.      برای جمع آوری خون از لوله های استریل حاوی ماده ضد انعقاد سدیم سیترات EDTA(لوله آزمایش با دربِ بنفش) استفاده شود.

2.      در صورت نمونه گیری در خارج از آزمایشگاه، نمونه باید در شرایط خنک و طی کوتاه ترین زمان ممکن به آزمایشگاه ارسال شود (خون کامل را می توان حداکثر تا 72 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری کرد ولی برای نگهداری نمونه در زمان های طولانی تر لازم است در فریزر (20-) تا انجام مراحل بعدی که مربوط به استخراج DNA و PCR می باشد نگهداری شود.

آمنیون:

1.      پزشک آمنیوسنتز کننده باید  نمونه ها را در شرایط کاملاً استریل بگیرد و طی کوتاه ترین زمان ممکن به آزمایشگاه ارسال کند.

2.      نمونه آمنیون باید زرد کم رنگ و شفاف باشد.

3.      نمونه آمنیون باید عاری از هر گونه آلودگی با خون مادری باشد.

 

شرایط عدم پذیرش نمونه:

خون:

1.      نمونه هایی که در شرایط غیر استریل جمع آوری شده باشند.

2.      نمونه های خونی که فریز شده، منعقد شده و یا به شدت همولیز شده باشند.

3.      نمونه های جمع آوری شده در ظروف حاوی مواد ضد انعقاد غیر از EDTA (هپارین با غلظت بیش از 10 واحد در میلی لیتر سبب مهار PCR می شود لذا، از نمونه های هپارینه و نیز نمونه بیماران تحت درمان با هپارین نمی توان استفاده کرد).

4.      حجم نمونه ها کافی نباشد (حداقل 5 میلی لیتر خون محیطی مورد نیاز است).

5.      نمونه هایی که بر چسب مشخصات بیمار روی آنها نادرست یا مبهم باشد.

آمنیون:

1.      در نمونه های آمنیون باید به رنگ نمونه توجه شود نمونه نباید خونی(آلوده به خون مادر) و یا تیره باشد.

2. نمونه های آمنیون که حجم کمتر از 5 میلی لیتر داشته باشند.

پایداری نمونه:

خون:

1.      در دمای اتاق ناپایدار می باشد.

2.      در دمای 4 درجه سانتیگراد خون کامل به مدت 7 روز قابل نگهداری می باشد.

عوامل مداخله گر:

خون:

·         هپارین درمقادیر بالادر این آزمایش تداخل ایجاد میکند.

آمنیون:

·         نمونه آلوده به خون مادر باشد. از آنجایی که ممکن است نمونه های پیش از تولد) مایع آمنیوتیک یا پرزهای جفتی( با سلولهای مادری آلوده شوند، بنابراین بررسی این مورد از اهمیت زیادی برخوردار است. به عنوان مثال : در نمونه مایع آمنیوتیکِ به شدت خون آلود، احتمال اینکه نمونه مورد بررسی ترکیبی از سلولهای مادری و جنینی باشد زیاد است. در این موارد ممکن است که حضور DNA مادر مانع تفسیر صحیح نمونه های QF-PCRشود. اگر چه امکان تشخیص صحیح و دقیق بر روی برخی از این نمونه ها امکانپذیر است، اما در صورت وجود آلودگی با نمونه مادری، پیک آلل اضافه برای مارکرهای STR بر روی کروموزومها در نتایج مشاهده میشود که با نمونه نرمال، موارد تریزومی، تریپلوییدی یا موزاییسم سازگاری ندارد .

تست ( QF-PCR) چیست؟

واکنش زنجیره ای پلیمراز فلورسانس کمٌی (QF-PCR) (Quantitative Fluorescence- Polymerase Chain Reaction) یک روش آزمایشگاهی ارزان، سریع و قابل اطمینان برای تشخیص ناهنجاری در کروموزوم های ۱۳، ۱۸، ۲۱، X و Y (ناهنجاری های شایع تر) می باشد.  در این روش بخش کوچکی از DNA جنین تکثیر شده و یکسری از جایگاه ها یا STR (Short Tandem Repeat) را روی DNA مورد بررسی قرار می دهد. QF-PCR به طور عمده به عنوان یک آزمون سریع قبل از تولد برای تشخیص تریزومی­های شایع 21، 18، 13 و تغییر در کروموزوم های جنسی X و Y استفاده می شود که شایعترین آنها  تریزومی21 می­باشد. با استفاده از روش QF-PCR ناهنجاری های کروموزومی تا حدود ۹۹% از خانواده های مراجعه کننده می تواند قابل تشخیص باشد.مزایای اصلی روش QF-PCR دقت، سرعت و کم هزینه بودن این تست نسبت به دیگر تست­های ژنتیکی می­باشد که این امکان را به وجود می آورد ناهنجاری های شایع کروموزومی پیش از تولد تشخیص داده شوند. آزمایش کروموزومی با روش QF-PCR در حدود 3 روز کاری زمان نیاز دارد. البته در مواردی لازم است این آزمایش روی همان نمونه تکرار شودکه این زمان را طولانی تر می کند.

تفسیر:

در این تکنیک توالی های DNA تکراری ویژه کروموزوم که به عنوان توالی های کوتاه تکراری(STR) (Short Tandem Repeat) شناخته می شود توسط PCR تکثیر می شود.با استفاده از پرایمرهای نشاندار شده با فلورسنت تعیین کمیت محصولات PCR صورت می گیرد.تعیین کمیت با محاسبه نسبت مساحت پیک مشخصی از STR مربوطه با استفاده از دستگاه تعیین توالی خودکار انجام می شود.اندازه  STRها در بین افراد مختلف  بسته به تعداد تکرار های موجود روی هر آلل با هم متفاوت اند. انتظار می رود که DNA ی تکثیر شده از افراد نرمال که برای یک مارکر STR ویژه هتروزیگوت (آنهایی که آلل هایی با طول متفاوت دارند) هستند دو پیک با طولی کمی متفاوت و با مساحت سطح یکسان و مشابه را نشان دهد..( مارکر های STR ای که هتروزیگوس هستند informative در نظر گرفته می شود ولی DNAتکثیر شده از افراد که تریزومی هستند، یا سه پیک تقریبا  یکسان(تریزومی تری آللیک ) و یا دو پیک که یکی دو برابر دیگری (تریزومی دی آللیک ) است را نشان می دهد.

اساس تفسیر نتایج:

دراین روش مقدار کمّیِ مارکرهای STR هر قطعه به صورت پیک بر روی نمودار دیده می شود. محدوده زیر هر پیک در الکتروفروگرام، نشان دهنده مقدار کمی محصول PCR ایی است که تکثیر شده است. ارتفاع هر پیک نشان دهنده میزان فعالیت ماده فلوئورسانت است که مقدار کمی ماده فلوئورسانت هر مارکر را نمایش میدهد. این نتایج به صورت الکتروفورگرام در نرم افزارهای آنالیز دیده میشوند. ارتفاع و محدوده مربوط به هر پیک نیز در این نرم افزار قابل مشاهده هستند.محدوده و ارتفاع (Height - Area) نشان دهنده میزان فعالیت ماده فلوئورسانت و در نتیجه بیانگر میزان محصولPCR  میباشند.

کاربردهای بالینی:

1. تشخیص سریع اختلالات کروموزومی شایع  شامل سندرم داون(تریزومی21)، سندرم ادوارد(تریزومی18) و سندرم پاتو (تریزومی13)
2. بررسی سلامت جنین در صورت مشکوک بودن نتایج غربالگری سه ماهه اول
3. تعیین جنسیت جنین
4. تشخیص سریع اختلالات کروموزوم های جنسی X و Y (سندرم ترنرXO، سندرم کلاین فلترXXY، سندرم X سه گانه XXX، سندرم جاکوب XYY)
5. تشخیص انواع پلی پلوئیدی(تریپلوئیدی) در جنین یا جنین سقط شده
6. بررسی سریع اختلالات کروموزومی در مواردی که امکان کشت سلولی فراهم نباشد و یا زمان کافی برای کشت سلولی ندارند.

 

فواید بکارگیری تکنیک QF-PCR چیست؟

1.      اين روش داراى حساسيت و اختصاصیت بسيار بالايى است و به علت حساسیت بالای این تست، مقدار نمونه مورد نیاز برای بررسی کمتر از سایر روشها می باشد.

2.      بخش عمده ی این تست بطور اتوماتيك انجام می شود و همين امر باعث توان عملياتى بالا با صرف هزينه اى بسيار كم می گردد و همچنين تشخيص پيش از تولد سريع را براى كليه بارداری ها امكان پذير می سازد. به همين علت اضطراب حاصل از انتظار درازمدت والدين براى تكميل نتايج آزمايش كاريوتايپ را كاهش داده است.

3.      کارایی این تکنیک تحت تأثیر سن جنین نیست و در هر زمان از بارداری قابل انجام است.

4.      این روش سریع تر وکم هزینه تر از تکنیک کاریوتایپ می باشد.

محدودیت های تکنیک QF-PCR چیست؟

1.      این روش قادر به بررسی همه کروموزوم ها نمی باشد و تنها  کروموزوم های 21 و 18 و 13 و X و Y را شناسایی می نماید.

2.      در صورت وجود موزائیسم استفاده از این تکنیک مناسب نمی باشد.

3.      در بعضی از موارد نادر نتایج مبهمی بدست می آید که نیاز به تکرار آزمایش است.

4.      روشـی قابـل اطمینان برای تشـخیص حذف هـای کروموزومی و ریزحذف ها نمی باشـد.

5.      این تکنیک قادر به شناسایی تریزومی های جزئی نمی باشد.

6.       در مـوارد بسـیار نـادری جـواب آزمایش نمـی تواند گویای وضعیـت کلیـه مارکرهـا بـر روی یک یا چنـد کروموزوم باشـد. در ایـن مـوارد نمونـه ها بـه روش FISH یـا کاریوتایـپ مورد بررسـی قرار خواهنـد گرفت.

7.      در بعضی از موارد نادر نیاز به تائید نتایج با استفاده از کاریوتایپ و یاMLPA می باشد.

8.      چگونگی بررسی تعداد کروموزومها به مارکرهای هتروزیگوت بستگی دارد. چنانچه همه مارکرهای روی یک کروموزوم هموزیگوت باشند، نمیتوان به نرمال یا غیر نرمال بودن آن کروموزم پی برد. البته چنین اتفاقی معمولا در یکی دو محل از کل مارکرها ممکن است اتفاق بیافتد. متخصص ژنتیک میبایست با توجه به کروموزوم درگیر و احتمال وقوع حذف تمامی یا بخشی از کروموزوم مربوطه در مورد نتیجه نهایی تصمیم بگیرد. مثال جنین مبتلا به مونوزومی کروموزوم 13و18و21 غیر ممکن است تا هفته 10 بارداری زنده بماند.

آزمایش QF-PCR به چه افرادی توصیه می شود؟

بررسی کروموزومی نمونه جنینی برای خانمهایی که احتمال اختلال کروموزومی در آنها بیشتر است، توصیه می شود از جمله:

1.      سن بالای 35 سال در هنگام بارداری

2.      جواب آزمایشات حین بارداری موسوم به تست سه گانه یا چهارگانه  Triple test یا Quadruple test که مشکوک به وجود اختلالات کروموزومی باشد.

3.      جواب سونوگرافی بارداری مشکوک به اختلال کروموزومی در جنین باشد.

4.      داشتن فرزند مبتلا به اختلال کروموزومی(زنده یا فوت شده)

5.      داشتن اختلال کروموزومی متعادل در خود یا همسر

6.      سن بارداری از 17 هفته کامل گذشته باشد و زمان کافی برای مجوز ختم بارداری بر اساس کاریوتایپ آمنیون وجود نداشته باشد.

منابع:

1.      C.G. Unite, “ professional guidelines for clinical cytogenetic and clinical molecular genetics QF-PCR for the diagnosis of aneuploidy, ” no. 200, pp. 1-16, 2012.

2.      “AneufastTM Analysis Troubleshooting Guide 1.1.1.”

3.      A .R. T. No, “Devyser Extend,” no. 8, pp. 1–24, 2012. 1–38.