نام اختصاری: BK and JC Virus PCR

سایر نام ها:

a.       QBK

b.      BKV Quantitative DNA

c.       BKV Quant

d.      BKV DNA

e.       JC DNA

f.       JCV Qualitative DNA

g.      John Cunningham Virus (JCV)

h.      Progressive Multifocal Leukoencephalopathy (PML)

بخش انجام دهنده: بیولوژی مولکولی (Department of Molecular Biology)

نوع نمونه قابل اندازه گیری:

نمونه مورد نیاز می تواند یکی از موارد ذیل باشد:

سرم، پلاسما و یا ادرار

حجم نمونه مورد نیاز:

سرم یا  پلاسما ml 1، ادرار ml 3.5

شرایط نمونه گیری:

1.      نیاز به ناشتایی نمی باشد.

2.      نمونه گیری باید در شرایط استریل انجام شود.

ملاحظات نمونه گیری:

1.             از ظرف های مخصوص و یکبار مصرف برای جمع آوری نمونه استفاده شود.

2.             برای جمع آوری خون یا پلاسما از لوله های استریل حاوی ماده ضد انعقاد استفاده شود.

3.             ماده ضد انعقاد مورد نیاز برای جمع آوری خون یا پلاسما می تواند EDTA یا سیترات باشد.

4.      پس از نمونه گیری باید سرنگ و سر سرنگ در یک سطل ایمنی (Safety Box) جمع آوری گردیده و سپس سوزانده شود.

5.    پس از گرفتن نمونه خون باید لوله حاوی نمونه سانتریفیوژ شود و در ادامه پس از جدا سازی سرم یا پلاسما، بلافاصله نمونه در فریزر قرار گیرد و تا انجام مراحل بعدی که مربوط به استخراج DNA و PCR می باشد، در ºC20- نگهداری شود.

6.             محل نمونه گیری از لحاظ خونریزی بررسی شود.

7.      در صورت نمونه گیری در خارج از آزمایشگاه، نمونه باید در شرایط خنک و سرد و طی کوتاه ترین زمان ممکن به آزمایشگاه ارسال شود.

8.      سطوح کار باید همواره قبل از شروع و پس از پایان کار با دستمال آغشته به الکل 70% و یا وایتکس 10% تمیز شود.

موارد عدم پذیرش نمونه:

1.      نمونه گیری نادرست و در شرایط غیر استریل.

2.       قرار دادن نمونه در درجه حرارت بالا و ذوب و فریز مکرر نمونه.

3.    در این آزمایش از نمونه های هپارینه نمی توان استفاده کرد (هپارین با غلظت بیش از 10 واحد در میلی لیتر سبب مهار PCR می شود). همچنین نمونه بیماران تحت درمان با هپارین نیز برای PCR مناسب نیست.

شرایط نگهداری:

1.   سرم یا پلاسما باید طی چند ساعت اولیه پس از خون گیری جدا سازی شده و تا زمان انجام  آزمایش، در دمای ºC 20-  نگهداری شود. سایر نمونه های مورد استفاده نیز باید طی چند ساعت اولیه پس از نمونه گیری در دمای ºC 20-  قرار داده شده و از ذوب و فریز مکرر آنها تا زمان انجام مراحل بعدی آزمایش خودداری شود.

4.       جهت حمل و نقل نمونه لازم است نمونه در شرایط سرد حمل شود.

5.      در صورت نبود شرایط برای انتقال نمونه در 24 ساعت اولیه، نمونه را در ^oC 20- فریز نمایید.

کاربردهای بالینی:

ارزیابی دقیق وضعیت BKV و JCV در بیماران دریافت کننده پیوند و ایمنو ساپرسیو، جهت جلوگیری از عوارض ناشی از فعالیت مجدد ویروس الزامی می باشد.

اطلاعات تکمیلی:

برای اولین بار استوارت پس از شناسایی و مشاهده شکل گیری چندین نوع تومور در نوزاد موش های آلوده با یک عامل ویروس ناشناخته، این ویروس کشف شده را به عنوان پولیوما نام گذاری کرد. این نام گذاری مشتق از نام یونانی پلی به معنی چندین و اوما بود که دلالت بر سرطان داشت. از آن پس عامل ایجاد این سرطان در موش به نام ویروس پولیومای موشی (Mouse Polyoma Virus) عنوان گردید. تا به امروز دو پولیوما ویروس انسانی مهم به نام JCV و BKV شناخته شده است که در سال 1971 برای اولین بار از بیماران دچار نقص ایمنی جدا شدند. امروزه مشخص شده که این دو ویروس در اغلب جمعیت های انسانی وجود دارند )90-60 درصد بالغین به لحاظ آنتی بادی علیه این دو پولیوما ویروس مثبت هستند) و سبب عفونت پایدار تحت بالینی در افراد سالم می گردند و سپس تحت شرایط نقص ایمنی دوباره فعال می گردند.

به طور کلی آغاز اپیدمی HIV به افزایش شدید در میزان بروز بیماری ناشی از JCV منجر گردید و استفاده از داروهای سرکوب گر ایمنی در بیماران گیرنده پیوند، منجر به افزایش بروز بیماری ناشی از ویروس B.K گردید.

ویریون پولیوما ویروس ها شامل پارتیکل های 45 – 40 نانومتری، با تقارن بیست وجهی و بدون پوشش لیپیدی هستند. ژنوم پولیوما ویروس ها شامل یک DNAی دو رشته ای حلقوی با طول Kb 5 و همراه با هیستون های سلولی است.

تماس اولیه با پولیوما ویروس های انسانی معمولاً بدون علامت است. عفونت معمولاً در طی دوران کودکی یا اولین بلوغ رخ می دهد و سپس به ماندگاری ویروس در میزبان در تمام عمر منجر می گردد. پایداری ویروس معمولاً در کلیه ها برقرار می شود و سپس از طریق ادرار دفع می شود. علاوه بر پایداری فعالیت ویروس، حالت نهفتگی ویروس نیز می تواند برقرار شود که در آن صورت DNA ویروس ممکن است درون کروموزوم سلول وارد شده و یا به صورت اپیزومال باقی بماند و سپس تحت شرایط خاص در  میزبان مثل سرکوب ایمنی و یا شرایط التهابی دوباره فعال گردد. به نظر
می رسد کلیه برای ویروس BK محل اصلی نهفتگی باشد در حالی که علاوه بر کلیه ها، اندام های لنفوئیدی نیز محل نهفتگی برای ویروس JCV هستند.

بررسی سرولوژیک جمعیت ها از طریق شناسایی آنتی بادی هایی که دلالت بر تبدیل حالت سرمی منفی به مثبت (سروکانورژن) در ویروس BK دارند نشان می دهد که عفونت به وسیله این ویروس در سن 5 تا 7 سالگی رخ می دهد (65 تا 90 درصد کودکان مثبت هستند) و عفونت در مورد ویروس JC در سنین بالاتر اتفاق می افتد. آنتی بادی ها در سراسر زندگی باقی می مانند. آنتی بادی های IgM و IgA در گیرندگان پیوند مغز استخوان و کلیوی شناسایی شده است. با مقایسه دو ویروس BK و JC به نظر می رسد که BKV به میزان بیشتری نسبت به  JCV در افراد آلوده به ویروس HIV دفع
می شود. پولیوما ویروس ها می توانند از طریق مسیر تنفسی، دهانی، تماس جنسی و خون منتقل شوند.

در مطالعات انجام شده در ایران میزان مثبت بودن DNAی ویروس BK در نمونه ادرار بیماران دریافت کننده پیوند کلیه بین 40 – 38 درصد و در نمونه پلاسمای بیماران بین 26 – 20 درصد گزارش شده است. در مطالعات انجام شده در سایر نقاط دنیا میزان مثبت بودن DNAی ویروس BK در نمونه ادرار بیماران دریافت کننده پیوند کلیه بین 57-30 درصد و در نمونه پلاسمای بیماران بین 30-13 درصد گزارش شده است.

روش مرجع: بیوپسی از بافت کلیه و مغز

 

روش ارجح:             

Real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR)

سایر روشها:             

a.       Anatomopathology

b.       Cytology

c.        Immunohistochemistry

مقادیر طبیعی:Negative

مقادیر مرجع:Negative

تفسیر:

لکوانسفالو پاتی چند کانونی پیش رونده (PML) یک بیماری دِمیلینه شونده در افراد مبتلا به نقص ایمنی است که به وسیله عفونت ویروس JC در الیگودندروسیت ها (سلول های تولید کننده میلین در ماده سفید مغز انسان) ایجاد می شود. نواحی دِمیلینه شده، زخم های پلاک چند کانونی را شکل می دهند که الگودندریسیت های بزرگ شده و هایپرکروماتیک، ماکروفاژها و آستروسیت های غیر معمول به عنوان ویژگی های هیستوپاتولوژی بیماری PML هستند.

اگرچه بیماری PML در بالغین مبتلا به نقص شدید ایمنی یافت می شود، ولی می تواند در هر زمان در طی زندگی حتی در کودکان نیز رخ دهد. در مغز افراد مبتلا به PML واکنش ایمنی ایجاد می شود و لنفوسیت های B و آنتی بادی علیه پروتئین VP₁ کپسید ویروس در مایع مغزی نخاعی وجود دارد که نشان دهنده پاسخ ایمنی در مغز است. بیماران مبتلا به PML ضعف عضله، اختلال در راه رفتن و نقایص حسی و بینایی را بروز می دهند.

عفونت اولیه ویروس BK بدون علامت بوده و یا ممکن است با بیماری خفیف دستگاه تنفسی (شبیه آنفلوانزا) همراه باشد، با این وجود سیستیت هموراژیک ناشی از عفونت ویروس اولیه در کودکان نیز گزارش شده است. سلول های T سیستم ایمنی به طور ویژه در مبارزه با BK ویروس دخیل هستند. بیمارانی که دچار فعالیت مجدد ویروس BK می شوند، عمدتاً شامل دریافت کنندگان پیوند کلیه، دریافت کنندگان پیوند مغز استخوان، بیماران مبتلا به لوپوس اریتماتوز، زنان باردار، ایمونوساپرسیوها و بیماران مبتلا به HIV هستند.

فعالیت مجدد ویروس BK مشکلات جدی را در بیماران دارای نقص ایمنی ایجاد می کند (مخصوصاً بیماران دریافت کننده داروهای سرکوبگر ایمنی پس از دریافت پیوند). تقریباً 60 درصد بیماران دریافت کننده پیوند کلیه  و 50 درصد بیماران دریافت کننده پیوند مغز استخوان با فعالیت مجدد BK ویروس مواجه می شوند که منجر به نفروپاتی و سیستیت هموراژیک در 8 درصد بیماران شده و در بیش از 15 درصد موارد ممکن است با رد پیوند همراه باشد.

40 درصد گیرندگان پیوند کلیه ویروس BK را به طور موقت یا دائم در طی هفته ها یا ماه ها دفع می کنند. رد پیوند ممکن است به طور مستقیم به وسیله ویروس BK یا واکنش های پیش التهابی ایجاد شود.

آنتی ژن T پولیوما ویروس با اتصال به پروتئین رتینوبلاستومای سلولی (PRb)، سبب جدا شدن PRb از فاکتور رونویسی E₂F شده و سبب فعال شدن رونویسی ژن های سلولی مربوط به فاز S می شود. ورود نامناسب سلول به فاز S سبب فعال شدن پروتئین P₅₃ می شود که آنتی ژن T با اتصال به P₅₃، سبب غیر فعال شدن آن شده و چرخه تکثیر سلول ادامه می یابد.

مطالعات نشان داد که بیان انکوپروتئین های ویروس با برخی از سرطان ها در ارتباط است. DNAی ویروس BK در تعداد زیادی از تومورهای بدن از جمله RhabdomyoSarcoma، ریه، کاپوزی سارکوما، پانکراس، کبد، مغز و دستگاه ادراری یافت می شود. مطالعات مختلف نشان داد که DNAی ویروس BK در 46 درصد تومورهای مغزی، 20 درصد از موارد کاپوزی سارکوما و 60 درصد تومورهای دستگاه ادراری جداسازی شده است.

پیشرفت نفروپاتی ناشی از فعالیت مجدد ویروس BK بدون علائم بالینی است. بهترین مارکر برای پیگیری بیماران، میزان بار ویروس در نمونه ادرار و پلاسمای بیماران است. افزایش بار ویروسی یک ریسک فاکتور برای ایجاد نفروپاتی بوده و ممکن است سبب بروز ویرمی و پیشرفت نفروپاتی شود.

بهترین روش جهت تشخیص نفروپاتی ناشی از فعالیت مجدد ویروس بیوپسی از بافت کلیه است ولی به دلیل تهاجمی بودن این روش (invasive method)، روش Real time PCR به عنوان بهترین تکنیک  جهت پیگیری و مدیریت دریافت کنندگان پیوند است.

عوامل مداخله گر :

·        هپارین در مقادیر بالا در این آزمایش تداخل ایجاد می کند.

·    نمونه گیری و جداسازی پلاسما یا سرم در شرایط غیر استریل می تواند منجر به ایجاد نتایج مثبت کاذب گردد.

·    فضاهای مربوط به استخراج DNA، آماده سازی مواد مورد نیاز واکنش و فضای افزودن نمونه DNA به لوله PCR، برای جلوگیری از ایجاد نتایج مثبت کاذب باید از هم جدا باشند.

توضیحات:

·    حضور بیش از  10³ کپی ازBKV DNA  در هرml  نمونه پلاسمای بیماران با افرایش ریسک نفروپاتی در ارتباط است.

·        بار ویروسی بیش از 10⁴ کپی در هرml  از نمونه ادرار بیماران،  نشان دهنده خطر نفروپاتی است.

منابع :

1.      Charles J. Bechert, Vicki J. Schnadig, Deborah A. Payne, Jianli Dong. Monitoring of BK Viral Load in Renal Allograft Recipientsby Real-Time PCR Assay. Am J Clin Pathol 2010; 133: 242-250.

2.      Dorota Polz, Agnieszka Stec, Małgorzata Polz-Dacewicz. BK-virus (BKV) – structure, epidemiology and pathogenesis. Journal of Pre-Clinical and Clinical Research, 2013. Vol 7. No 2.

3.      M. Siguier, P. Sellier, J.-F. Bergmann.BK-virus infections: A literature review. Médecine et maladies infectieuses 42 (2012) 181–187.

4.      Deirdre Sawinski . Simin Goral. BK virus infection: an update on diagnosis and treatment.Nephrol Dial Transplant (2014) 0: 1–9

5.      Mark D. Reploeg, Gregory A. Storch, and David B. Clifford. BK Virus: A Clinical Review. Clinical Infectious Diseases 2001; 33:191–202

6.      Gholam Abbas Kaydani. Manoochehr Makvandi. Alireza Samarbafzadeh. Heshmatollah Shahbazian. Mojtaba Hamidi Fard. Prevalence and Distribution of BK virus Subtypes in Renal Transplant Recipients Referred to Golestan Hospital in Ahvaz, Iran.Jundishapur J Microbiol. 2015 March; 8(3): e16738.

7.      M Shenagari, M Ravanshad, SY Hosseini, R Ghanbari.Detection and Prevalence of Polyoma Virus BK among Iranian Kidney Transplant Patients by a Novel Nested-PCR. IRCMJ 2010; 12(6):631-635

8.      Ajit P Limaye.Keith R Jerome.Christian S Kuhr. James Ferrenberg.Meei-Li Huang.Connie L Davis. Lawrence Corey. Christopher L Marsh.Quantitation of BK Virus Load in Serum for the Diagnosis of BK Virus–Associated Nephropathy in Renal Transplant Recipients.

9.      MayoMedicalLaboratories.com. QBK Clinical: BK Virus, Molecular Detection, Quantitative, PCR, Plasma

10. MayoMedicalLaboratories.com. QBKU Clinical: BK Virus, Molecular Detection, Quantitative, PCR, Urine

11. MayoMedicalLaboratories.com. FJCV Overview: JC Polyoma Virus DNA, Quantitative RealTime PCR, Plasma