نام اختصاری: OF

سایر نام ها: آزمایش شکنندگی اُسمزی گلبول های قرمز،

RBC Fragility, whole blood/  Red Cell Fragility/ Osmotic Fragility, RBC/ Erythrocyte  fragility test, 

بخش انجام دهنده: هماتولوژی

نوع نمونه قابل اندازه گیری: خون کامل (ٍِحاوی ضد انعقاد هپارین یاEDTA )

حجم نمونه مورد نیاز:  4 ml

شرایط نمونه گیری:

1.  نمونه باید در کمتر از  96 ساعت پس از خونگیری به آزمایشگاه ارسال شود.

2.  نمونه بیمار باید خون کامل حاوی ضد انعقاد EDTA به همراه نمونه کنترل باشد.

ملاحظات نمونه گیری:

1.  همزمان با نمونه گیری از بیمار، یک نمونه خون به عنوان نمونه کنترل از یک فرد سالم، غیر خویشاوند و  غیر سیگاری بگیرید.

2.  نمونه را به یک ویال اورجینال با در پوش بنفش یا سبز انتقال دهید. نمونه را الیکوت نکنید.

3.  با برچسب واضحی، لوله حاوی نمونه بیمار را از نمونه کنترل مجزا کنید. جنس فردی که نمونه کنترل از آن گرفته شده را بر روی برچسب یادداشت نمایید.

4.  پس از نمونه گیری بلافاصله نمونه را در یخچال قرار دهید.

5.  نمونه بیمار و ویال کنترل را با یک باندل پلاستیکی به هم متصل کنید.

6.  تاریخ تولد بیمار را در برگه آزمایشگاه ذکر کنید.

موارد عدم پذیرش نمونه:

ü      همولیز شدید

ü      نمونه لخته

ü      نمونه یخ زده (فریز شده)

ü      نمونه بدون برچسب یا با برچسب اشتباه

ü      استفاده از ضد انعقاد اگزالات یا سیترات.

شرایط نگهداری: نمونه بیمار و نمونه کنترل در دمای یخچال (4^oC) به مدت 4 روز پایدار می باشد. در دمای اتاق و در دمای فریزر (-20^oC) قابل نگهداری نیست.

کاربردهای بالینی:

1.      ارزیابی موارد مشکوک به کم‌خونی همولیتیک اسفروسیتوز ارثی (HS)  و تأیید آن.

2.      ارزیابی استوماتوسیتوز ارثی، لیپتوسیتوز همراه با بیماری کبدی، آنمی میکروسیتیک هیپوکرومیک ( نظیر  فقر آهن) و فقر آنزیم پیروات کیناز.

3.       ارزیابی حالات همولیتیک ایمنی اکتسابی نظیر  اسفروسیتوز اکتسابی.

اطلاعات تکمیلی:

 اسفروسیتوز ارثی(HS) یک کم خونی همولیتیک شایع با طیف وسیع از نظر شدت است. بیماران مبتلا، همولیز مزمن دارند ولی ممکن است از نظر بالینی بدون علامت باشند یا از همولیز جبران نشده شدیدی رنج ببرند که به برداشتن طحال پاسخ می‌دهد.  HS ناشی از نقایص ارثی در اسکلت غشاء اریتروسیت است. یک سری از پروتئین‌ها با یکدیگر تعامل کرده و غشاء گلبول قرمز را تشکیل داده که با لیپید لایه خارجی لیپیدی نیز تعامل می‌کنند. تعاملات عمودی، دو لایه لیپید را تثبیت کرده که شامل تعاملات اسپکترین- انکرین- باند 3 و اتصال پروتئین 4.1- گلیکوفورین می‌باشد. تعاملات عرضی مسئول تمامیت ساختاری غشاء گلبول قرمز است. به نظر می‌آید HS یک اختلال در تعاملات عمودی می‌باشد. در نتیجه، دو لایه لیپیدی بی‌ثبات شده، لیپید از دست رفته و ناحیه سطحی غشاء دچار نقص شده که نهایتاً منجر به اسفروسیتوز می‌شود. در مطالعات چهار نوع اختلال ساختاری غشاء گلبول قرمز شناسایی شده است که به ترتیب زیر است:
نقص ترکیبی اسپکترین و آنکرین که شایع­ترین نقص است.

نقص باند 3
نقص اسپکترین به تنهایی
نقص پروتئین 4.2

 HS با کم‌خونی همولیتیک جبران‌نشده، ممکن است همراه با رتیکولوسیتوز (معمولاً خفیف تا متوسط) و افزایش خفیف بیلی‌روبین غیرمستقیم سرم باشد. این بیماران مستعد به سنگ‌های پیگمانی کیسه صفرا و حملات آپلاستیک مغز استخوان هستند. اسفروسیت‌ها نسبت به گلبول­های قرمز طبیعی به همولیز در سالین رقیق (هیپوتونیک) حساس‌ترند و شکنندگی اُسمزی (OF) آنها افزایش می‌یابد. اسفروسیت‌ها از هر منشا که باشند از جمله کم‌خونی همولیتیک اتوایمیون (AIHA)، موجب افزایش OF خواهند شد. به طور کلی سلول­های کاملاً گرد یعنی اسفروسیت‌ها یا سلول­های اسفروئیدال افزایش OF دارند در حالی که سلول­هایی که نسبت سطح به حجم آنها بالاتر است مثل سلول­های نازک، هیپوکرومیک و  تارگت،OF  کاهش یافته دارند.
در HS، پیرو پوی کیلوسیتوز ارثی و استوماتوسیتوز ارثی،  OF افزایش یافته است ولی در الیپتوسیتوز ارثی، OF طبیعی است. از سوی دیگر در گزروسیتوز ارثی (xerocytosis)،  OF کاهش می‌یابد.

 OF در مواردی از آلودگی با مالاریا افزایش می‌یابد، که هم سلول­های آلوده و هم غیرآلوده این افزایش را نشان می­دهند. گزارش شده که در مبتلایان به اسکلروز متعدد (MS) هم OF و هم شکنندگی مکانیکی (Mechanical Fraction) افزایش می‌یابد. کاهش OF (مقاومت به لیز) ممکن است با فقر آهن (جمعیت سلول­های هیپوکروم)، سایر هموگلوبینوپاتی‌ها (به خصوص بیماری هموگلوبین C ) احتمالاً به خاطر جمعیت سلول­های تارگت دیده شده و مشخصه تالاسمی است.

روش متداول: لیز اسمزی : گلبول­های قرمز را در یک سری از لوله‌های حاوی محلول هیپوتونیک کلریدسدیم (NaCl) با غلظت‌های 9/0 تا صفر درصد به صورت معلق در ‌آورده و پس از گذشت 30 دقیقه در دمای اتاق، لوله‌ها را سانتریفیوژ نمایید. درصد همولیز در محلول رویی، اندازه‌گیری و برای هر غلظت NaCl  نقطه‌ای رسم می‌شود. سلول­های کروی­تر که نسبت سطح به حجم کمتری دارند، دارای ظرفیت محدودتری برای اتساع در محلول هیپوتونیک بوده و نسبت به گلبول­های قرمز طبیعی در غلظت بالاتری از   NaCl لیز می‌شوند و در نتیجه OF بالاتری دارند. در صورتی که خون به مدت 24 ساعت در 37 º C انکوبه شود، خون مبتلایان به HS مشخصاً افزایش بیشتری را در شکنندگی در مقایسه با خون طبیعی یا حتی مبتلایان به اسفروسیتوز اکتسابی نشان می‌دهد. 

روش مرجع: -

روش ارجح: -

سایر روشها: روش مستقیم در pH:7.4 در دمای 20^oC، روش  انکوباسیون استریل به مدت 24 ساعت در 37^oC ، روش لیز بر پایه گلیسرول

مقادیر مرجع:

روش مستقیم در pH:7.4 در دمای 20^oC: همولیز در کلرید سدیم 0.5 درصد (0.5 گرم در دسی لیتر) شروع و در 0.3 درصد کامل می‌شود.

روش  انکوباسیون استریل به مدت 24 ساعت در 37^oC: همولیز در کلرید سدیم 0.7 درصد شروع و در 0.3 درصد کامل می‌شود.

تفسیر: شکنندگی اسمزی از مهمترین آزمایشاتی است که برای بیماران مشکوک به داشتن آنمی همولیتیک ( نظیر اسفروسیتوز ارثی) با علل مختلف درخواست می شود. با این آزمایش می توان تا حد زیادی به نواقص غشاء گلبول قرمز پی برد. در این آزمایش، گلبول های قرمز (RBCs) در یک سری لولهء حاوی محلول هیپوتونیک NaCl با غلظت متغییر به حالت تعلیق در می آیند و پس از گذشت مدت زمان لازم، درصد همولیز اندازه گیری و وضعیت آن با منحنی حالت نرمال مقایسه می شود. در مواردی چون اسفروسیتوز ارثی، اسفروسیتوز اکتسابی با منشاء ایمنی و در استوماسیتوز ارثی شاهد افزایش شکنندگی و در آنمی های میکروسیتیک هیپوکرومیک (نظیر تالاسمی و آنمی فقر اهن) و لیپوسیتوزیس همراه با بیماری کبدی کاهش آن را ملاحظه می کنیم. در مواردی که فقر آنزیم پیروات کیناز و گلوکز-6-فسفات دهیدروژناز (G6PD) وجود دارد باز هم شکنندگی افزایش می یابد.

محدودیت ها و عوامل مداخله گر :

§         هر کم‌خونی شدیدی از جمله فقر آهن سبب  نتایج غیرطبیعی خواهد شد.

§         این تست وجود اسفروسیت‌ها و سلول­های اسفروئیدال را اندازه‌گیری می‌کند و برای HS اختصاصی نیست.

§         جهت آ‍زمایش احتیاج به خونگیری بدون تروما است.  همولیز شدید در نتایج آزمایش تداخل می نماید.

§         بیماران دچار آنمی همولیتیک ایمونولوژیک و یا کسانی که اخیراٌ تزریق خون داشته اند ممکن است دچار افزایش لیز RBC و افزایش OF گردند.

توضیحات:

·         تشکیل اسفروسیت‌ها (گلبول­های قرمز کروی) ناشی از دست دادن سطح غشایی گلبول قرمز نسبت به حجم داخل سلولی است. در حضور گلبول­های قرمز کروی OF افزایش می‌یابد.OF  غیرطبیعی در اسفروسیتوز ارثی (HS) اتفاق می‌افتد ولی منحصراً  تشخیصی نیست. 

·         لیز RBC در یک غلظت محلول NaCl دال بر مثبت شدن تست نمی باشد.  در صورتی که در  3  غلظت محلول NaCl افزایش لیز داشته باشیم نشاندهنده شکنندگی اُسمزی RBC می باشد.

·         جهت تفسیر تست باید به همراه تست بیمار نمونه کنترل نیز گزاشته شود. و نتایج با یکدیگر مقایسه گردند.

·         در صورتی که تست OF بیمار نرمال باشد ولی تست کنترل غیر طبیعی باشد، تست را می توان گزارش کرد. منتها باید در جواب آزمایش آورد که نمونه کنترل رضایت بخش نبوده است.

·         در صورتی که هر دو نمونه بیمار و کنترل OF غیر طبیعی داشته باشند، آزمون باطل خواهد بود و نباید گزارش گردد.

       منابع :

1. کتاب جامع تجهيزات آزمايشگاهي و فرآورده هاي تشخيصي- دکتر حميد رضا سقا و همکاران- نشر مير
2. کتاب خون شناسي- انعقاد و طب انتقال خون هنري- ديويدسون 2011
3. سايت مايو کلنيک (Mayo mediacal laboratories): http://www.mayomedicallaboratories.com/test-catalog/Overview/9064

4. Childrens Hospital and clinics of Minnesota: http://www.childrensmn.org/manuals/lab/Hematology/019020.asp

5. Jacobs S. D, DeMott R. W, Oxley K. D, Laboratory test handbook, 3 rd,Lexi comp,2004,pp:980-983