نام اختصاری: HPV PCR  

سایر نام ها:

HPV DNA Detection, High Risk HPV, HPV (Human Papillomavirus) PCR, Human Papillomavirus (HPV) Genotyping.

بخش انجام دهنده: بیولوژی مولکولی (Department of Molecular Biology)

نوع نمونه قابل اندازه گیری:

نمونه تناسلی نظیر نمونه تهیه شده از بخش های خارجی یا داخلی سرویکس، واژن و یا سایر بخش های تناسلی، و نیز سایر نقاط بدن نظیر پوست، گلو و غیره که درگیر عفونت ویروسی شده اند.

حجم نمونه مورد نیاز: نمونه های تناسلی و نمونه های حاصل از زخم، یک سواب.

شرایط نمونه گیری:

1.       نیاز به ناشتایی نمی باشد.

2.       نمونه گیری باید در شرایط استریل انجام شود.

ملاحظات نمونه گیری:

1.              از ظرف های مخصوص و یکبار مصرف برای جمع آوری نمونه استفاده شود.

2.              جهت نگهداری سوابی که حاوی نمونه مورد نظر است، از لوله های استریل حاوی  PBS
(Phosphate buffered saline) استفاده شود.

3.          نمونه گردآوری شده باید بلافاصله در فریزر قرار گیرد و تا انجام مراحل بعدی که مربوط به استخراج DNA و PCR می باشد، در ºC20- نگهداری شود.

4.              در صورت نمونه گیری در خارج از آزمایشگاه، نمونه باید در شرایط خنک و سرد و طی کوتاه ترین زمان ممکن به آزمایشگاه ارسال شود.

5.              سطوح کار باید همواره قبل از شروع و پس از پایان کار، با دستمال آغشته به الکل 70% و یا وایتکس 10% تمیز شود.

موارد عدم پذیرش نمونه:

1.       نمونه گیری نادرست و در شرایط غیر استریل.

2.        قرار دادن نمونه در درجه حرارت بالا و ذوب و فریز مکرر نمونه.

3.       شرایط نگهداری:

1.       نمونه های مورد استفاده باید طی چند ساعت اولیه پس از نمونه گیری در دمای ºC20- قرار داده شده و از ذوب و فریز مکرر آنها تا زمان انجام مراحل بعدی آزمایش خودداری شود.

4.        جهت حمل و نقل نمونه لازم است نمونه در شرایط سرد حمل شود.

5.       در صورت نبود شرایط برای انتقال نمونه در 24 ساعت اولیه، نمونه را در ^oC 20- فریز نمایید.

کاربردهای بالینی:

ردیابی و تشخیص به موقع آلودگی با ژنوتایپ های پر خطر ویروس پاپیلوم انسانی(HPV) ، که در ایجاد سرطان گردن رحم  دخالت دارند.

اطلاعات تکمیلی:

سرطان دهانه رحم یا سرویکس دومین سرطان شایع در زنان می باشد که در مراحل اولیه معمولا بدون علائم است و تنها در مراحل پیشرفته همراه با درد می باشد. تقریبا منشاء تمام انواع سرطان های سرویکس، ویروس پاپیلومای انسانی (HPV)
می باشد که جزء بیماری های مقاربتی محسوب می شود و می تواند موجب تغییر شکل سلول ها و تبدیل آنها به سلول های سرطانی شود. حتی 25 درصد از سرطان های دهان نیز به واسطه عفونت با ویروس پاپیلومای انسانی ایجاد می شود. HPV، ویروسی کوچک، بدون پوشش و دارای DNAی دو رشته ای با ژنومی نزدیک به 8000 نوکلئوتید است. ویروس های پاپیلوما تمایل بسیار زیادی به سلول های پوششی پوست و سلول های مخاطی دارند. اسید نوکلئیک ویروس سلول های
پایه ای را آلوده می سازد ولی بیان ژن های رمز کننده پروتئین های کپسید به بالاترین لایه سلول های شاخی پوست محدود می شود. مراحل چرخه تکثیر ویروس، احتمالاً به عوامل اختصاصی مربوط به مراحل مختلف تمایز سلول های اپیتلیال بستگی دارد. لذا این وابستگی شدید تکثیر ویروس به سلول میزبان تمایز یافته، موجب شده که تکثیر ویروس های پاپیلوم در آزمایشگاه با مشکلات زیادی همراه باشد. بیش از 118 تیپ مختلف از ویروس HPV شناسایی شده است که به سه گروه ریسک زیاد (پر خطر)، ریسک کم (کم خطر) و ریسک طبقه بندی نشده تقسیم می شوند. مطالعات اپیدمیولوژیک و مولکولی نشان داده اند که درحدود 40 نوع از تیپ های مختلف ویروس HPV قادر به ایجاد عفونت در لایه مخاطی سیستم تناسلی انسان می باشند که از میان تیپ های آلوده کننده، 14 تیپ آن شامل تیپ های 16، 18، 31، 33، 35، 39، 45، 51، 52، 56، 58، 59، 66 و 68 به عنوان تیپ های پر خطر جهت ایجاد سرطان دهانه رحم شناخته شده اند. به علاوه از میان ژنوتایپ های فوق الذکر، انواع 16 و 18 بیشترین اهمیت را در ایجاد سرطان سرویکس دارند و در این بین، HPV نوع 16 مؤثرتر بوده و تقریبا 60 درصد سرطان های سرویکس به تیپ 16 آلوده اند در حالی که تنها حدود 15 – 10 درصد سرطان های سرویکس به تیپ 18 آلوده اند. انواع کم خطر می توانند سبب ایجاد زگیل در اندام تناسلی و یا اطراف آن در زن و مرد شوند. تیپ های 6 و11 عامل ایجاد حدود 90 درصد زگیل های تناسلی می باشند. نقش انواع طبقه بندی نشده از لحاظ میزان ارتباط با سرطان دهانه رحم هنوز مشخص نیست اما از لحاظ آماری ریسک آنها حداقل می باشد. لذا تشخیص به موقع تیپ های پر خطر ویروس و انجام اقدامات سریع درمانی می تواند از پیشرفت ضایعات ایجاد شده در جهت سرطانی شدن سلول ها جلوگیری نماید.

روش مرجع: -  

روش ارجح: تشخیص ژنوتایپ ویروس با استفاده تکنیک PCR

سایر روشها: روش پاپ اسمیر، روش سیتولوژی غوطه ور در مایع یا (Liquid Based Cytology) LBC و روش های مختلف مبتنی بر PCR نظیر Hybrid Capture II، PCR مبتنی بر توالی های حفظ شده، RFLP، هیبریداسیون معکوس و تعیین توالی مستقیم

مقادیر طبیعی:  DNA ویروس  HPV در نمونه های حاصل از افراد سالم قابل ردیابی نیست.

نکته: تعیین ژنوتایپ ویروس به روش Conventional PCR انجام می شود بنابراین، میزان DNAی ویروس در نمونه مورد آزمایش باید به اندازه ای باشد که پس از تکثیر توسط واکنش PCR به روش کیفی، قابل ردیابی توسط الکتروفورز روی ژل آگارز باشد.

تفسیر:

همچنان که پیشتر ذکر شد، وابستگی شدید تکثیر ویروس پاپیلوما به سلول میزبان تمایز یافته، موجب شده که تکثیر ویروس در آزمایشگاه و تشخیص عفونت از طریق روش های کشت ویروس دشوار باشد. متاسفانه با کمک روش سیتولوژیکی پاپ اسمیر نیز در مراحل اولیه درگیری فرد با ویروس، امکان تشخیص ویروس وجود ندارد. لذا به علت پایین بودن حساسیت آزمایش پاپ اسمیر، تعیین ژنوتایپ آلوده کننده ویروس به وسیله PCR به عنوان ابزاری مناسب برای غربال گری سرطان و یا پیگیری نتایج غیر طبیعی پاپ اسمیر رواج یافته است. بررسی ها نشان داده اند که روش PCR حساس تر از روش سیتولوژی است ولیکن از نظر اختصاصیت پایین تر است. لذا طبق توصیه های انجمن زنان و مامایی و انجمن سرطان زنان آمریکا، آزمایش HPV PCR به همراه آزمایش سیتولوژی سرویکس می تواند به عنوان روش غربالگری به کار رود.

در روش PCR که به صورت کیفی انجام می شود، با استفاده از پرایمر های اختصاصی برای ژنوتایپ های مختلف ویروس پاپیلوما، ابتدا مرحله تکثیر ژنوم ویروس توسط دستگاه ترموسایکلر صورت گرفته و در ادامه محصول PCR به وسیله الکتروفورز روی ژل آگارز و مشاهده قطعه مورد نظر توسط دستگاه Gel Doc قابل ردیابی است.

عوامل مداخله گر:

·         نمونه گیری در شرایط غیر استریل می تواند منجر به ایجاد نتایج مثبت کاذب گردد.

·         فضاهای مربوط به استخراج DNA، آماده سازی مواد مورد نیاز واکنش و فضای افزودن نمونه DNA به لوله PCR، برای جلوگیری از ایجاد نتایج مثبت کاذب باید از هم جدا باشند.

توضیحات:

·         نتیجه «Undetected»  نشان می دهد که DNA ویروس در نمونه یافت نشده است.

·         مشاهده قطعه DNAی مربوط به هر یک از ژنوتایپ های مورد بررسی روی ژل الکتروفورز بیانگر فعالیت ویروس و تکثیر آن در بیمار است.

·         تشخیص عفونت با حضور مقادیر قابل تشخیص و سنجش DNA  ویروس در نمونه مورد آزمایش امکان پذیر است.

·         در صورت عدم ردیابی DNA ویروس در نمونه بیمار، احتمال آلودگی به ویروس رد نمی گردد چرا که فاکتورهایی همچون تجزیه اسید نوکلئیک یا تداخل بعضی از مواد با آمپلیفیکاسیون ممکن است وجود داشته ‌باشد.          

منابع :

1.     سایت مایو کلنیک: http://www.mayomedicallaboratories.com/test-catalog/Specimen/62599.

2.     میکروبیولوژی پزشکی جاوتز، گنو اف. بروکس، ت مهدی خزعلی، نشر حیان، 2004 ISBN: 964-460-800-3

3.     مرتضي جبارپور بنيادي، محسن اسماعيلي، علي دسترنج. تعیین انواع انکوژن ویروس پاپیلومای انسانی به روش PCR چند گانه در ضایعات سرطانی دهانه رحم در منطقه شمال ایران. فصل نامه بیماری های عفونی و گرمسیری وابسته به انجمن متخصصین بیماری های عفونی و گرمسیری. سال سیزدهم، شماره 41، صفحات 29 تا 34، تابستان 1387.

4.     احمد توکلی، سید محمود سید خرمی، اصغر اشرفی حافظ، احمد خلیل نژاد، بهناز شوهانی. کارسینوژنز: نقش ویروس ها در پاتوژنز سرطان های انسانی. مجله علمی پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی ایلام، دوره بیست و یکم، شماره هفتم، بهمن 92.

5.        Chris J. Meijer, Peter J. Snijders, Philip E. Castle. (2006). Rapid Communication Clinical utility of HPV genotyping. Gynecologic Oncology. 103:  12–17.