نام اختصاری: HCV RNA Detect / Quant

سایر نام ها:

HCV (RT-PCR) Quantitation, HCV PCR, HCV Quantitation, HCV RNA Quantitation HCV Titer, HCV Viral Load, Hepatitis C Quantitation, Hepatitis C RNA Quantitation, Hepatitis C Titer, Hepatitis C Viral Load

بخش انجام دهنده: بیولوژی مولکولی (Department of Molecular Biology)

نوع نمونه قابل اندازه گیری: پلاسما، سرم، بافت کبد

حجم نمونه مورد نیاز:  5 ml

شرایط نمونه گیری:

1.       نیاز به ناشتایی نمی باشد.

2.       نمونه گیری باید در شرایط استریل انجام شود.

ملاحظات نمونه گیری:

1.       لازم است نمونه گیری در شرایط استریل و در لوله های حاوی EDTA صورت گیرد و بافت کبدی پس از نمونه گیری در یک ظرف استریل یا کیسه پلاستیکی درب بسته قرار می گیرد.

2.       پس از نمونه گیری باید سرنگ و سر سرنگ در یک سطل ایمنی (Safety Box ) جمع آوری گردیده و سپس سوزانده شود.

3.       از لوله های مخصوص و یکبار مصرف برای جمع آوری نمونه استفاده شود.

4.       پس از نمونه گیری باید لوله حاوی نمونه سانتریفیوژ شود و در ادامه پس از جدا سازی سرم یا پلاسما، بلافاصله نمونه در فریزر قرار گیرد و تا انجام مراحل بعدی که مربوط به استخراج RNA و PCR می باشد، در ºC 20 – نگهداری شود.

5.       محل نمونه گیری از لحاظ خونریزی بررسی شود.

6.       در صورت نمونه گیری در خارج از آزمایشگاه، نمونه باید در شرایط خنک و سرد و طی کوتاه ترین زمان ممکن به آزمایشگاه ارسال شود.

7.       برای تهیه پلاسما از مواد ضد انعقاد EDTA یا سدیم سیترات استفاده شود.

موارد عدم پذیرش نمونه:

1.       نمونه گیری نادرست و در شرایط غیر استریل.

2.        قرار دادن نمونه در درجه حرارت بالا و ذوب و فریز مکرر نمونه.

3.        در این آزمایش از نمونه های هپارینه نمی توان استفاده کرد.

شرایط نگهداری:

1.       پس از جدا سازی سرم یا پلاسما در شرایط استریل، باید تا زمان انجام  آزمایش، آن را در دمای ºC 20- نگه دارید.  سرم باید طی چند ساعت اولیه پس از خون گیری از لخته جدا شده و  به صورت منجمد نگهداری شود. بافت کبد نیز باید تا زمان انجام آزمایش های بعدی در ^oC 20- نگهداری شود.

2.       جهت حمل و نقل نمونه لازم است نمونه در شرایط سرد حمل شود.

3.       در صورت نبود شرایط برای انتقال نمونه در 24 ساعت اولیه ، نمونه را در ^oC 20- فریز نمایید.

کاربردهای بالینی:

1.       ردیابی عفونت حاد ویروس هپاتیت C، قبل از ظهور آنتی بادی های HCV در سرم (یعنی کمتر از 2 ماه پس از قرار گرفتن در معرض عفونت ویروسی).

2.       ردیابی و تأیید عفونت مزمن ویروس هپاتیت C  ( (HCV

3.       تعیین کمی HCV-RNA  در سرم بیماران مبتلا به عفونت مزمن HCV که سابقاًHCV-Ab  مثبت بوده اند.

4.       نظارت بر پیشرفت بیماری در عفونت HCV مزمن و یا پاسخ به درمان ضد HCV.

اطلاعات تکمیلی:

هپاتیت C نوعی التهاب کبدی است که توسط ویروسی با همین نام ایجاد می شود و در حال حاضر نزدیک به 180 میلیون نفر در دنیا به این ویروس آلوده اند. ژنوم ویروس هپاتیت C از یک زنجیره RNA به طول تقریبی 9500 نوکلئوتید تشکیل می شود.  بر خلاف سایر ویروس های هپاتیت شامل D, B, A و یا E، عفونت با ویروس هپاتیت C، در تعداد زیادی از بیماران مبتلا به آن، منجر به بیماری کبدی مزمن می شود. عفونت با HCV در اغلب موارد برای مدت طولانی بدون علامت می باشد. به همین دلیل بسیاری از بیماران، از ابتلائشان به ویروس اطلاع ندارند و این در حالی است که بیشترین اثر درمانی مربوط به مراحل اولیه بیماری است. در حال حاضر، اینترفرون α به صورت ترکیب با ریباویرین، تنها درمان مؤثر علیه ویروس محسوب می شود.

تحقیقات نشان می دهند که مطمئن ترین روش برای تشخیص این بیماری یافتن RNA ویروس با روش RT – PCR در نمونه می باشد. با این روش تشخیص بیماری حدود چند هفته تا چند ماه زودتر از روش های مبتنی بر جستجوی آنتی بادی امکان پذیر می شود. همچنین با این روش می توان میزان ویروس
در خون بیمار را نیز سنجید و در نتیجه به عنوان بهترین روش برای ارزیابی موفقیت درمان و یا بررسی میزان پیشرفت بیماری و تفکیک انواع حاد، فعال و مزمن از یکدیگر شناخته می شود.

روش مرجع: -

 روش ارجح:  RNA Detection and Quantification by Real-Time PCR

سایر روشها:  PCR Conventional، RT-PCR، PCR amplification; Cobas HCV Test

مقادیر طبیعی:  RNA ویروس  HCV در نمونه های سرم یا بافت کبدی افراد سالم وجود ندارد و نباید ردیابی شود. 

محدوده قابل سنجش: IU/ml  10⁸ × 250 – 25

تفسیر:

ردیابی ویروس در نمونه مورد آزمایش به وسیله PCR، بر اساس تکثیر نواحی اختصاصی از ژنوم ویروس صورت می گیرد. در حال حاضر روش Real Time PCR در مقایسه با سایر روش های ارزیابی میزان ویروس، دارای بیشترین حساسیت و وسیع ترین دامنه اندازه گیری می باشد. در این روش با استفاده از پروب های نشان دار شده به رنگ های فلوئورسنت می توان کیفیت و کمیت محصول PCR را بررسی نمود. بر همین اساس می توان تعداد ویروس را در نمونه مورد بررسی تعیین نمود بدون این که پس از پایان واکنش نیاز به انجام مراحل بعدی و باز کردن مجدد در تیوب ها پس از PCR باشد. لذا امکان ایجاد آلودگی نیز به لحاظ تئوری وجود نخواهد داشت.

عوامل مداخله گر :

·         هپارین در مقادیر بالا در این آزمایش تداخل ایجاد می کند.

·         نمونه گیری و جداسازی پلاسما یا سرم در شرایط غیر استریل می تواند منجر به ایجاد نتایج مثبت کاذب گردد.

توضیحات:

·         نتیجه «Undetected»  نشان می دهد که RNA ویروس هپاتیت  (HCV) C در نمونه یافت نشده است.

·         نتایج کمی بیان شده به واحد IU/ml  نشان دهنده میزان فعالیت ویروس HCV و تکثیر آن در بیمار است.

·         نتایج کمی بر پیشرفت بیماری در عفونت HCV مزمن و یا پاسخ به درمان ضد HCV نظارت می کند.

·         ارزیابی آزمایشگاهی وضعیت عفونت HCV باید با آزمایشات سرولوژیک  HCV آغاز گردد. از جمله، آزمایش از نظر وجود HCV-Ab  مورد ارزیابی قرار گیرد.

·         تشخیص عفونت مزمن  HCV صرفاً با حضور مقادیر قابل تشخیص و سنجش RNA  ویروس در نمونه سرم امکان پذیر نیست.

·         در صورت عدم وجود RNA ویروس در نمونه سرم بیمار و مثبت بودن HCV-Ab ، احتمال آلودگی به ویروس HCV رد نمی گردد.

          منابع :

1.     سایت مایو کلنیک: . http://www.mayomedicallaboratories.com/test-catalog/Overview/83142

2.     میکروبیولوژی پزشکی جاوتز، گنو اف. بروکس، ت مهدی خزعلی، نشر حیان، 2004 ISBN: 964-460-800-3

3. artus HCV RG RT-PCR Kit handbook, QIAGEN

Kit Real time RT PCR handbook, Novin Gene 4. HCV RG